Estimation of biological dose of radiation based on the number of chromosomal aberration in the cells with chromosomes less than 45
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摘要:目的
探讨人体外周血淋巴细胞数目少于45条的染色体用于估算辐射生物剂量的可行性。
方法以受照后的人外周血进行细胞培养并制备染色体, 全自动染色体分析系统扫描拍摄分裂象图像, 以染色体形态良好作为分裂象的遴选标准, 分为标准染色体组(46 ±1条)、非标准染色体组(40~44条)和混合组, 计数并分析所有入选的中期分裂象, 估算受照剂量。
结果3组的估算剂量与照射剂量的误差均在5%以内, 非标准染色体组的估算结果略高于标准染色体组。
结论数目少于45条的染色体与标准染色体在分析染色体畸变时差异较小, 可以用于辐射生物剂量估算的补充。
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人外周血淋巴细胞染色体畸变分析是辐射生物剂量估算公认的“金标准”[1]，国家标准[2-3]及相关技术文件规定，染色体畸变-辐射剂量效应曲线建立和辐射生物剂量估算需分析一定数量（46 ± 1）条染色体的中期分裂象。在检测工作中染色体数目少于45条的分裂象无法避免，染色体分散过度和使用染色体全自动分析系统时染色体丢失的现象更加多见，数目少于45条的分裂象需要剔除，极大地增加了人工阅片的工作量。长期应用免疫抑制剂、大剂量电离辐射和年长者等的细胞培养困难的样品，每一个可分析的分裂象都很重要。本研究拟对比外周血淋巴细胞非标准染色体（40 ~ 44条）与标准染色体[（46 ± 1）条]阅片结果，并对采用数目少于45条染色体估算辐射生物剂量的准确性进行评价，探讨其用于辐射生物剂量估算的可行性。
1. 材料与方法
1.1 染色体制备
本研究采集2名健康志愿者外周静脉血，全血照射在中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所进行。照射条件如下：60Co γ射线放射源，剂量率为0.28 Gy/min，分1.0、2.0、3.0 Gy 3个剂量点进行照射。受照血样采用改良全血微培养法[4]进行培养，接种0.8 mL血样至4.0 mL含160 μg/mL植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）、112 IU/mL庆大霉素、37.5 IU/mL肝素和0.04 μg/mL秋水仙素的RPMI 1640培养基中，在37 ℃下培养52 h，常规方法制片，湿片过火法分散染色体，10%姬姆萨染液染色10 min，流动自来水冲片并晾干待检。
1.2 标本片扫描
每个照射剂量点3张片，用ZEISS Meta Systems全自动染色体扫描分析系统进行整片扫描，选择染色体形态良好的分裂象在油镜下拍照。
1.3 阅片分析
染色体分裂象图像由有5年以上染色体畸变分析工作经验的工作人员进行分析，每个畸变由另两名有同等经验的工作人员确认。以染色体形态好、易于分析、条数≥ 40、染色体虽有丢失但仍集中于同一视野作为分裂象入选标准。分析所有符合上述条件的分裂象，并记录所有细胞分裂象的染色体条数、染色体畸变类型及数目。
1.4 数据处理
染色体畸变，特别是双着丝粒+着丝粒环（dic + r）是估算辐射剂量的重要指标。分析染色体个数及（dic + r）数量，根据“1个N着丝粒=（N - 1）个双着丝粒”，将多着丝粒数量转换成双着丝粒数量。染色体数目符合（46 ± 1）条标准的分裂象统计到“标准染色体”组，直接计算畸变率[（dic + r）数量/细胞数]；40 ~ 44条染色体的分裂象统计到“非标准染色体”组，通过公式“染色体畸变数× 46/染色体个数”转换成标准染色体的畸变率。统计标准染色体组、非标准染色体组以及混合组（标准染色体组+非标准染色体组）的分析结果，依据实验室建立的生物剂量效应曲线估算受照剂量，与受照剂量进行比较，分析估算结果的相对误差。
2. 结果
每个剂量点分成A（标准染色体组）、B（非标准染色体组）、C（A组+B组）3组，统计染色体畸变分析结果，用实验室生物剂量效应曲线y = 8.190 × 10-2 D2 + 7.885 × 10-2 D + 1.844 × 10-3，估算每组的受照剂量。式中，y为（dic + r）畸变率，单位：细胞数-1；D为估算剂量，单位：Gy。3组的估算剂量与照射剂量的误差均在5%以内，B组的估算结果略高于A组。见表 1。
表 1 三个剂量染色体片分析结果受照剂量 组别 分析细胞数 （dic+r)数量/细胞 估算剂量/Gya 误差/% 1.0Gy A组 610 0.162 3 1.00(0.86~1.13) 0.00 B组 133 0.172 9 1.04(0.73~1.30) 4.00 C组 743 0.164 2 1.01(0.88~1.12) 1.00 2.0Gy A组 595 0.487 4 2.00(1.86~2.13) 0.00 B组 140 0.500 0 2.03(1.73~2.30) 1.50 C组 735 0.489 8 2.0(1.88~2.13) 0.50 3.0Gy A组 584 0.946 9 2.95(2.81~3.09) -1.67 B组 149 1.006 7 3.05(2.76~3.32) 1.67 C组 733 0.959 1 2.97(2.84~3.09) -1.00 [注] a为估算剂量平均数（95%可信区间） 3. 讨论
人外周血淋巴细胞染色体畸变分析是估算受照剂量的一种可靠的生物学指标，在国内外辐射事故中已有许多的应用实例。在辐射事故中，患者在受照剂量较大时，淋巴细胞损伤严重，细胞培养变得非常困难，标本中分裂细胞较少，估算剂量相对误差偏大[5]；有的甚至培养73 h后仍得不到可分析的分裂象[6]。正因如此，保证可供分析的染色体分裂象在辐射生物剂量估算中非常重要，纳入数目少于45条的染色体可增加生物剂量估算时分析细胞数。
在染色体畸变分析过程中，受细胞培养、样品制备等众多环节的影响，染色体标本的质量有高有低，形态也各不相同，如滴片后加热温度太高会引起分裂象不完整，染色体散在[7]，这就容易导致部分染色体数目达不到（46 ± 1）条的标准。本实验室采用ZEISS Meta Systems全自动染色体辅助分析染色体畸变，非标准染色体比例在10% ~ 40%之间，直接剔除这些细胞加大了后期分析的工作量，甚至需重新扫描拍照增加可分析细胞数。本研究3个剂量点染色体数少于45条的分裂象分别占17.9%、19.0%和20.3%，在人工预选细胞时，会事先将数目明显偏少的分裂象剔除，入选分裂象以44条、43条染色体为主。
染色体数目少于45条的分裂象中，丢失的染色体是随机的，畸变染色体、正常染色体都有可能在视野中丢失，这种随机性使得标准染色体与非标准染色的畸变率具有可比性，利用这些分裂象估算受照剂量成为可能。本研究中，3组的估算剂量与照射剂量的误差均在5%以内，加入非标准组对剂量估算的影响在1%以内。非标准染色体的畸变率较标准染色体稍高，其原因可能是因为含有dic和r的细胞更容易丢失染色体。
虽然本研究中采用数目不足45条的染色体进行辐射生物剂量估算也能得到比较满意的结果，但相对于标准染色体，非标准染色体在分析中存在更多的不确定性，检查人员间分析结果的差异较大。因此，实验室应从提高细胞培养技术和制片技术来减少非标准数目染色体的出现。特殊情况下，如突发应急事故发生时，受试者淋巴细胞死亡率高、转化率及分裂指数低，导致可供分析的中期分裂象数量不足时，可以尝试将数目少于45条的染色体纳入计数分析范围，用于辐射生物剂量估算的补充。
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表 1 三个剂量染色体片分析结果
受照剂量 组别 分析细胞数 （dic+r)数量/细胞 估算剂量/Gya 误差/% 1.0Gy A组 610 0.162 3 1.00(0.86~1.13) 0.00 B组 133 0.172 9 1.04(0.73~1.30) 4.00 C组 743 0.164 2 1.01(0.88~1.12) 1.00 2.0Gy A组 595 0.487 4 2.00(1.86~2.13) 0.00 B组 140 0.500 0 2.03(1.73~2.30) 1.50 C组 735 0.489 8 2.0(1.88~2.13) 0.50 3.0Gy A组 584 0.946 9 2.95(2.81~3.09) -1.67 B组 149 1.006 7 3.05(2.76~3.32) 1.67 C组 733 0.959 1 2.97(2.84~3.09) -1.00 [注] a为估算剂量平均数（95%可信区间） 
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[1] International Atomic Energy Agency.Cytogenetic dosimetry:Applications in preparedness for and response to radiation emergencies[M].Vienna:IAEA, 2011.
[2] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会.染色体畸变估算生物剂量方法: GB/T 28236-2011[S].北京: 中国标准出版社, 2012. [3] 中华人民共和国卫生和计划生育委员会.放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价: GBZ/T 248-2014[S].北京: 中国标准出版社, 2014. [4] GUO Y, ZHANG W, GAO C X, et al. A simple method for human whole blood microcultures and its application in radiation biodosimetry[J].Health Phys, 2015, 109(4):323-326. doi: 10.1097/HP.0000000000000331
[5] 吕玉民, 傅宝华, 韩林, 等.河南"4·26" 60 Co源辐射事故受照者的生物剂量(染色体畸变)估算[J].中华放射医学与防护杂志, 2001, 21(3):153-155. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2001.03.003 [6] 黄敏燕, 刘建香, 阮健磊, 等.山东济宁60 Co辐射事故受照人员的生物剂量估算[J].中华放射医学与防护杂志, 2007, 27(1):25-26. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2007.01.007 [7] 陈德清, 刘清杰.人体染色体畸变检测应用手册[M].北京:人民卫生出版社, 2011:44-45.
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