Variation of platelet mtDNA D-loop region in patients with chronic benzene poisoning
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+ English摘要:目的
检测职业性慢性苯中毒(occupational benzene poisoning, CBP)患者血小板线粒体DNA (mtDNA) D-loop 区基因变异情况, 分析它们与CBP发病的可能关系。
方法选取35例初诊的CBP患者(病例组)与35例正常体检者(对照组), 提取血小板mtDNA并对mtDNA D-loop 区序列行PCR扩增, 通过测序对PCR扩增产物基因序列进行检测, 并将测序结果与修订的剑桥标准序列和国际线粒体数据库(MITOMAP数据库)进行比对, 并比较两组的基因变异情况。
结果在D-loop 区共7个变异位点中, 相比对照组, 病例组血小板线粒体基因CA 514 d位点出现变异的OR值为5.740(95% CI:1.906~17.282, P < 0.01)。
结论CBP的血小板mtDNA D-loop 区基因变异可能与CBP发病有关。
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近年来，我国一些地区职业性慢性苯中毒(occupational benzene poisoning，CBP)病例呈逐年增多趋势[1]。苯及苯系物主要对机体血液系统造成损害，严重者会出现再生障碍性贫血，甚至造成白血病[2]。文献报道提示，苯中毒主要与苯进入体内生成的中间活性代谢产物作用于线粒体而引起的氧化损伤有关[3]。有研究表明慢性苯中毒的发生除与苯的接触浓度有关外，还与接触者的遗传易感性有关[4]。作为核外DNA的线粒体基因，mtDNA调控着呼吸链的关键酶，这些基因的变异会引起线粒体功能的失调。D-loop 区是mtDNA的主要的非编码区，参与并调节mtDNA的复制与转录，并且与其修复有关[5]。线粒体是血小板中唯一具有遗传功能的细胞器[6]，分离后的血小板可直接提取DNA用于线粒体基因分析。因血小板线粒体D-loop 区基因对与苯中毒发病机制有关的线粒体功能调控起着重要的作用，本研究拟对深圳市职业病防治院2015—2017年职业性慢性苯中毒患者进行血小板线粒体D-loop 区基因变异频率的分析，以探讨CBP患者mtDNA D-loop 区基因变异的特点。现将结果报告如下。
1. 对象与方法
1.1 对象
病例组选择35名轻度苯中毒患者。纳入标准：依据《职业性苯中毒的诊断》(GBZ 68-2013)[7]确诊为职业性慢性苯中毒患者。排除标准：1)有线粒体相关疾病；2)有吸烟、饮酒史；3)有遗传疾病或家族史；4)有长期X射线或其他放射线接触史。
对照组选择35名健康体检者。纳入标准：体检结果健康者。排除标准：1)有苯接触史和线粒体相关疾病；2)有吸烟、饮酒史；3)有遗传疾病或家族史；4)有长期X射线或其他放射线接触史。
两组受试者均抽取肘部血液样本5 mL，EDTA抗凝。
1.2 方法
1.2.1 仪器设备
ABI StepOnePluss荧光PCR扩增仪(美国应用生物公司)、可调定量加液器(德国塞默科学公司)、超净工作台(中国济南鑫贝西生物技术有限公司)、分光光度计(日本日立科学仪器公司)、XE-5000血液分析仪(日本SYSMEX公司)、电动离心机(美国贝克曼库尔特公司)。
1.2.2 主要配套试剂
GoTaq Long PCR Master Mix PCR反应试剂[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]；人类基因组柱式血液DNA提取试剂、双蒸水、DNA引物合成物[均来自生工生物工程(上海)股份有限公司]。
1.2.3 血小板提取
EDTA抗凝全血标本以100 g离心力离心10 min，取上清液加入离心管；取剩余上清液与红细胞混合液800 μL于另一支离心管中，以170 g离心力离心10 min，再取上清液加入到第一次分离上清液的离心管中，小心轻轻混匀30 s；将收集的所有上清液以210 g离心力离心3 min，重复上一步骤一次。去掉沉积在离心管底部的细胞层，保留上层的富血小板血浆[8]。
1.2.4 细胞DNA的提取
吸取200 μL富血小板血浆，加入到1.5 mL离心管中，再加入50 μL磷酸盐缓冲溶液(PBS)，混匀。加入20 μL蛋白酶K，混匀，再加入200 μL缓冲液震荡混匀，并于56 ℃水浴10 min。向上述离心管中加入200 μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2 min，再用7 000 g离心力室温离心1 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL清洗液，以7 000 g离心力离心30 s倒掉废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入清洗液，以7 000 g离心力离心30 s倒掉废液。将吸附柱重新放回收集管中，以10 000 g离心力室温离心2 min，去除残留的清洗液。取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL离心管中，加入100 μL DNA溶解液，静置3 min，以1 000 g离心力离心2 min，收集DNA溶液，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20 ℃保存。
1.2.5 PCR反应体系
反应体系采用GoTaqⓇLong PCR Master Mix反应试剂，其中Master Mix反应液10 μL，正向、反向引物(10 pmol/μL)各1 μL，双蒸水6 μL，DNA 2 μL(阴性对照以双蒸水代替DNA)，总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃60 s，35个循环。正向引物：GATCACAGGTCTATCACCCT(5，→3，)，反向引物：GGGTGTGCTCTTTTAGCTGT(5，→3)。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，用于评估扩增产物的大小(1 948 bp)。对PCR产物进行纯化和测序分析[生工生物工程(上海)股份有限公司]。获得的序列通过nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)和BioEdit软件与修订的剑桥标准线粒体基因序列(NC_012920.1)以及MITOMAP数据库对比分析，检测线粒体该区域基因变异情况。
1.2.6 统计学分析
实验数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理。计数资料组间差异采用χ2检验，计量资料采用均数±标准差(x ± s)表示，组间差异采用t检验，基因分布差异采用比值比分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 两组研究对象一般情况比较
病例组平均年龄(37.8 ± 10.1)岁，男性10人，女性25人；对照组平均年龄(40.2 ± 7.0)岁，男性14人，女性21人。病例组和对照组观察对象的年龄、性别差异均无统计学意义(t年龄 = - 1.220，χ性别2 = 1.014，P > 0.05)。
2.2 电泳结果
所有受试者PCR产物均经琼脂糖凝胶电泳，均在约1 948 bp处出现特异条带，与目的片段产物大小一致，证实成功扩增出D-loop 区片段。见图 1。
2.3 D-loop 区基因变异情况
针对D-loop 区基因位点在病例组和对照组的基因分型结果，采用比值比(OR)表示D-loop 区基因变异与职业性慢性苯中毒发病风险的相关性，结果显示：相比对照组，病例组中1种基因位点(CA 514 d)发生变异的OR值为5.740(P＜0.01)，表明其与职业性慢性苯中毒的发病可能具有相关性。见表 1。
表 1 D-loop 区基因变异与职业性慢性苯中毒发病风险的相关性变异位点 病例组 对照组 OR值 P值 95%CI值 总例数 变异例数(占比/%) 总例数 变异例数(占比/%) T 146 C 35 6(17.1) 35 1(2.8) 7.034 0.079 0.800~61.869 C 150 T 35 12(34.3) 35 7(20.0) 2.087 0.183 0.707~6.165 A 248 d 35 10(28.6) 35 6(17.1) 1.933 0.259 0.615~6.074 C 309 CCT 35 13(37.1) 35 15(42.8) 0.788 0.626 0.302~2.054 C 315 CC 35 14(40.0) 35 13(37.1) 1.128 0.806 0.431~2.955 T 489 C 35 16(45.7) 35 22(62.8) 0.498 0.152 0.191~1.293 CA 514 d 35 19(54.3) 35 6(17.1) 5.740 0.002 1.906~17.282 3. 讨论
苯对造血系统的毒性作用已经被大量研究证实，而且苯是国际上公认的致癌物质。近年的研究表明，在低浓度苯暴露环境中工作也会引起线粒体拷贝数和甲基化比率的变化，进一步证实了苯暴露可能产生的氧化损伤作用[2]。苯在体内的毒性作用过程是通过一系列苯的代谢物转化发生的，这些转化过程与苯代谢的关键基因调控有关[9]。线粒体是细胞内产生ATP的主要来源。线粒体DNA变异会触发氧化应激，发生氧化损伤。文献报道线粒体功能失调与血液系统疾病密切相关[10]。D-loop 区基因在mtDNA转录与复制调控过程中起重要作用，D-loop 区基因突变可能导致编码区变异，影响其对靶基因的调控[11]。
国内外文献检索未发现血小板线粒体D-loop 区基因变异与慢性职业性苯中毒存在相关性的报道。而本研究发现，D-loop 区基因位点CA 514 d变异与职业性慢性苯中毒的发病可能具有相关性。推测其原因，可能是mtDNA发生突变后，线粒体更容易发生氧化应激和损伤，突变后暴露于苯及苯系物环境中，对其代谢物的毒性作用更加敏感。ZHOU等[5]报道了D-loop 区基因T 152 C变异可能与急性髓细胞白血病发病有关，可能是易感性生物标志物。MOHAMED YUSOFF等[12]报道了马来西亚人群中线粒体D-loop 区基因变异与脑部肿瘤发病有关，XUN等[13]报道了线粒体D-loop 区序列多态性可作为脂肪肉瘤的风险生物标志物。
本研究选择血小板线粒体作为研究靶点，原因是其不含核基因，在基因检测的过程中可以排除核基因同源性序列的影响[14]，同时本研究采用特异性引物进行PCR扩增并选用序列鉴定的金标准Sanger测序法对基因序列鉴定，检测方法简单，结果可靠。由于本文收集的病例数量存在一定局限性，可能使得结果存在偏倚，故确切结论尚有待进一步临床验证。因此，我们将继续对线粒体D-loop 区基因特征及其所调控的靶点进行研究。
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表 1 D-loop 区基因变异与职业性慢性苯中毒发病风险的相关性
变异位点 病例组 对照组 OR值 P值 95%CI值 总例数 变异例数(占比/%) 总例数 变异例数(占比/%) T 146 C 35 6(17.1) 35 1(2.8) 7.034 0.079 0.800~61.869 C 150 T 35 12(34.3) 35 7(20.0) 2.087 0.183 0.707~6.165 A 248 d 35 10(28.6) 35 6(17.1) 1.933 0.259 0.615~6.074 C 309 CCT 35 13(37.1) 35 15(42.8) 0.788 0.626 0.302~2.054 C 315 CC 35 14(40.0) 35 13(37.1) 1.128 0.806 0.431~2.955 T 489 C 35 16(45.7) 35 22(62.8) 0.498 0.152 0.191~1.293 CA 514 d 35 19(54.3) 35 6(17.1) 5.740 0.002 1.906~17.282 
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