Analysis of liver autoimmune indices in patients with trichloroethylene-induced medicamentosa-like dermatitis
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+ English摘要:目的
探索三氯乙烯药疹样皮炎（occupational medicamentosa-like dermatitis induced by trichloroethylene，OMDT）引发的肝脏自身免疫情况。
方法选取10例OMDT慢性期患者和5名门诊随访的治愈者作为研究对象，检测肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）和自身免疫性肝炎（AIH）相关免疫指标[免疫球蛋白（IgG）、抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（ASMA）、抗肝肾微粒体抗体（LKM-1）、抗肝溶质抗原1型抗体（LC-1）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP）、抗线粒体亚型-2抗体（AMA-M2）]，比较、分析各指标在慢性期患者和治愈者中的水平。
结果慢性期患者肝功能指标ALT活性中位数（49.5 U/L）高于临床参考值，但IgG浓度（4.74~11.32 g/L）均在参考值范围内，且自身抗体指标均为阴性。治愈者ALT活性中位数（10.0 U/L）在参考值范围内，但其中1人（20%）IgG浓度高于临床参考值，ANA阳性率为60%，其他自身抗体指标均为阴性。慢性期患者ALT活性中位数高于治愈者，而治愈者ANA阳性率高于慢性期患者，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
结论OMDT患者在慢性期期间虽然肝功能受损，但可能未发生自身免疫；治愈后肝功能基本恢复，部分自身免疫指标却可能升高。
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三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是一种性能优良、应用广泛的工业有机溶剂，但同时也是一种工业毒物和环境污染物[1]。人群流行病学和动物实验研究均支持TCE具有免疫毒性，长期接触低剂量TCE可能引起针对自身组织抗原产生免疫病理损害的自身免疫病（autoimmune disease，AID）[2]。体内外实验研究表明TCE引起AID的机制可能与甲酰化半抗原蛋白、氧化应激产生脂质过氧化衍生醛类、TCE相关复合物引起T细胞激活和凋亡等有关[2]。职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational medicamentosa-like dermatitis induced by trichloroethylene，OMDT）是某些敏感个体短期接触较大剂量TCE后发生的泛发型皮肤炎性损害，常伴肝、心、肾等内脏器官受累[3-5]。研究表明，OMDT的发病机制主要是TCE引起的迟发型超敏反应[6-7]。虽然它与长期接触低剂量TCE对机体的毒作用机制不同，但该病通常伴严重肝实质细胞损害，血清转氨酶活性显著升高，在肝损害过程中患者自身肝组织抗原可能暴露，或与TCE代谢物形成新抗原，从而可能诱导这些免疫功能异常患者产生自身抗体，甚至继发自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）。AIH是因自身免疫反应而引起肝脏慢性炎症为表现的一种AID，突出特点是血清中存在自身抗体[8]。本研究拟在小样本病例人群中对OMDT可能诱导产生的肝脏自身免疫情况进行探索性分析，以期为后续职业流行病学调查提供基础资料。
1. 对象与方法
1.1 对象
经知情同意，我们于2014—2017年在深圳市职业病防治院就诊的患者中连续选取研究对象。病例纳入标准：符合《职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准》（GBZ 185-2006）[9]诊断，并在入院时的急性期排除AIH、病毒性肝炎和其他已知肝病，治愈者在门诊随访时排除一般肝炎病毒感染。凡不符合上述标准的病例均予以排除，最终共招募到慢性期患者10例和门诊随访治愈者5例。收集研究对象基本资料，其中吸烟是指连续或累积吸烟6个月及以上，且每天吸烟1支以上者，饮酒是指每周饮酒次数＞1次。抽取所有研究对象外周肘静脉血，分离得到血清样本，每人约1 mL，-80 ℃冻存备用。考虑到IgG抗体产生周期，OMDT患者血液样本采集时间点均选择在发病后至少21 d，其中采血时慢性期患者的病程平均为47.7 d，治愈者的痊愈时间平均为402.4 d，其中最短104 d，最长925 d。本研究遵守赫尔辛基宣言和其他衍生伦理准则，并经深圳市职业病防治院伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器和试剂
贝克曼库尔特全自动生化分析仪AU 5800、罗氏全自动生化分析仪Cobas c 702、奥林巴斯荧光显微镜B × 41、雷杜免疫印迹仪Blotray 866等。肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒来自贝克曼库尔特实验系统（苏州）公司；免疫球蛋白IgG检测试剂盒来自罗氏诊断产品（上海）有限公司；抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）、抗平滑肌抗体（anti-smooth-muscle antibody，ASMA）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP）、抗肝肾微粒体抗体（LKM-1）、抗线粒体亚型-2抗体（AMA-M2）、抗肝溶质抗原1型抗体（LC-1）检测试剂盒均来自德国欧蒙医学实验室诊断公司。
1.2.2 指标选择与检测
目前临床诊断AIH多采用国际AIH小组于2008年修订的简易评分系统，包括自身抗体检测、免疫球蛋白（IgG）、组织学、排除病毒感染四项，每项分别为0~2分，总分≥7分者确诊为AIH[10-11]。基于上述诊断标准，本研究设计在研究对象中检测血清IgG、ANA、ASMA、LKM-1、LC-1、SLA/LP、AMA-M2，以及ALT；用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪以速率法检测ALT；用罗氏全自动生化分析仪Cobas c 702以免疫比浊法检测免疫球蛋白IgG；用奥林巴斯荧光显微镜B × 41以间接免疫荧光法检测ANA，免疫荧光法检测ASMA；用雷杜免疫印迹仪Blotray866以免疫印迹法检测SLA/LP、LKM-1、AMA-M2、LC-1。
1.2.3 统计学分析
所有数据均采用STATA软件进行统计学分析，计量资料根据数据分布类型以中位数和第25、75百分位数表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验（Mann-Whitney U检验）；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，理论频数不符合其检验条件的采用Fisher确切概率法。所有检验均为双侧，检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1 研究对象基本情况
15名研究对象均无饮酒习惯。慢性期患者男性8人（占80.0%），汉族9人（占90%），有吸烟习惯者3人（占30%）；治愈者男性3人（占60.0%），汉族3人（占60%），有吸烟习惯者2人（占40%）。以上资料分布在两组间比较，差异均无统计学意义（χ2=0.682、1.875、0.150，P均> 0.05）。以中位数（P25~P75）计，可知：慢性期患者年龄为22.5（19.5~44.2）岁，接触TCE时间（基本相当于发病潜伏期）为30.0（28.0~33.5）d；治愈者年龄为21.0（18.5~26.5）岁，接触TCE时间为30.0（28.0~37.5）d。经秩和检验，两组年龄、接触时间差异均无统计学意义（Z=0.676、0.250，P均> 0.05）。研究对象基本人口学特征资料见表 1。
表 1 研究对象基本资料及指标检测结果编号 病例类型 年龄/岁 性别 TCE接触时间/d 临床分型 病程/da ALT(U/L) IgG/(g/L) ANA 1 慢性期患者 20 男 41 重症多形红斑 39 53.0 7.41 阴性 2 慢性期患者 49 男 54 重症多形红斑 50 46.0 5.39 阴性 3 慢性期患者 43 男 25 大疱性表皮松 18 19.0 7.93 阴性 4 慢性期患者 35 女 23 重症多形红斑 59 42.0 9.62 阴性 5 慢性期患者 24 男 30 重症多形红斑 71 227.0 5.90 阴性 6 慢性期患者 18 女 30 重症多形红斑 60 59.0 8.78 阴性 7 慢性期患者 21 男 30 重症多形红斑 47 44.0 7.61 阴性 8 慢性期患者 48 男 31 重症多形红斑 54 32.0 5.81 阴性 9 慢性期患者 17 男 31 重症多形红斑 61 274.0 4.74 阴性 10 慢性期患者 20 男 29 重症多形红斑 18 223.0 11.62 阴性 11 治愈者 18 女 30 重症多形红斑 601 10.0 8.53 阳性c 12 治愈者 21 男 30 重症多形红斑 259 6.0 40.38 阳性c 13 治愈者 24 男 37 多形红斑 104 88.0 8.29 阴性 14 治愈者 19 男 26 多形红斑 123 10.0 6.77 阳性c 15 治愈者 29 女 38 多形红斑 925 11.0 11.84 阴性 [注]a慢性期患者为采血时的病程，治愈者为痊愈时间；b重症多形红斑患者在后续治疗期间进展为大疱性表皮松解症；c滴度为1：100 2.2 两组对象各项临床指标比较
病例资料和生物样本采集时10例慢性期患者均被诊断为重症多形红斑，但在后续治疗期间有1例进展为大疱性表皮松解症。门诊随访的5例治愈者中有3例被诊断为多形红斑，2例被诊断为重症多形红斑。
以中位数（P25~P75）计，可知：慢性期患者ALT为49.5（39.5~224.0）U/L，IgG为7.51（5.70~8.99）g/L；门诊随访治愈者ALT为10.0（8.0~49.5）U/L，IgG为8.53（7.53~26.11）g/L。慢性期患者ALT中位数高于治愈者，差异有统计学意义（Z=2.207，P < 0.05）；但两组IgG中位数差异无统计学意义（Z=1.592，P > 0.05）。
以分布人数计，可知：80%的慢性期患者（8例）ALT活性高于临床参考值范围（7~40 U/L），但其IgG均未超过临床参考值20 g/L；而治愈者ALT活性超过参考范围、IgG > 20 g/L均为1人（占20%）。慢性期患者ALT活性高于临床参考值范围人数比例大于治愈者，差异有统计学意义（P < 0.05）；但两组IgG > 20 g/L的人数分布差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
2.3 两组对象其余AIH相关免疫指标检测结果比较
慢性期患者ANA阳性率为0，治愈者为60%，抗体滴度均为1:100。另外经统计发现，15名对象ASMA、LKM-1、LC-1、SLA/LP、AMA-M2指标均为阴性。由此可知，在所检测的自身免疫指标阳性率中，仅ANA阳性率在慢性期患者和治愈者间差异有统计学意义（P < 0.05）。
3. 讨论
TCE具有免疫毒性，实验研究证明长期接触低剂量TCE可能引起AID[2]。虽然OMDT的发病机制可能与长期接触低剂量TCE对机体的毒作用机制不同，但是该病所致肝损害可能会在患者免疫功能异常状况下引发自身免疫。到目前为止，文献中尚无关于OMDT患者发生自身免疫的报道。为初步探索OMDT可能引发肝脏自身免疫情况，本研究首先检测10例OMDT慢性期患者的AIH相关免疫指标，结果发现10例患者的自身抗体指标均为阴性。随后，我们又检测了5名门诊随访OMDT治愈者的免疫指标，结果发现其中1人（占20%）IgG浓度升高超过临床参考值20 g/L，3人（占60%）ANA为阳性。
所有研究对象均在入院时的急性期排除AIH，因此本研究中所检测的肝脏自身免疫指标均考虑为OMDT引发。由于IgG抗体产生周期是2~3周，因此我们采集血液样本的时间点均选择在发病后至少21 d。AIH在临床上分三型，除了通常伴ALT等肝功能指标增高外，还表现为血清特异性肝抗原相关自身抗体水平增高。ANA抗体至今被认为是诊断AIH最敏感的标志性抗体，据统计约75.0%的AIH-Ⅰ型患者呈ANA阳性[12]。ASMA与ANA在AIH患者中同样比较常见。LKM-1和LC-1均为AIH-Ⅱ型血清学指标，LC-1抗体对于AIH-Ⅱ型的特异性可达95%以上[12]。SLA/LP是Ⅲ型AIH患者最特异的指标，其阳性预测率几乎为100%[12]。此外，AMA-M2也是诊断自身免疫性肝病的重要自身抗体[12]。
本研究发现，慢性期患者ALT活性高于临床参考值，提示肝功能受损，但AIH相关自身抗体指标均为阴性，说明所检测的慢性期患者可能未发生自身免疫。我们推测的主要原因是患者在慢性期持续接受高剂量糖皮质激素治疗，对患者免疫系统功能产生抑制。目前，OMDT治疗方案基本都包括使用糖皮质激素等免疫抑制剂，因此患者的免疫功能只有在入院治疗前的急性期和治愈出院后不会受到抑制。由于入院治疗前的急性期基本不超过发病后20 d，此时即使发生自身免疫，IgG抗体也尚未产生，因此我们选择在门诊随访的5名治愈者中开展排除药物因素影响的进一步研究。这5名治愈者在门诊随访期间均已停止注射或口服糖皮质激素类药物，因此不受药物因素影响；但是停用激素药物指征一般是在皮疹和肝功能基本恢复正常且停药后病情无反弹，此时虽然患者免疫系统功能基本恢复正常，但大部分肝细胞损伤也得到修复。研究结果显示，大部分治愈者肝功能恢复正常，但部分治愈者的IgG和ANA结果出现异常，且ANA阳性率高于正常人群水平[13]，提示部分治愈者可能发生了一定程度的肝脏自身免疫反应。
总之，我们通过研究初步探讨了OMDT引发肝脏自身免疫的情况，研究结果尚需要在大规模治愈人群中作进一步验证。此外，本次研究主要针对多形红斑和重症多形红斑类型患者，其他OMDT临床类型患者发生肝脏自身免疫情况是否与本研究结果相同，仍须进一步探讨。
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表 1 研究对象基本资料及指标检测结果
编号 病例类型 年龄/岁 性别 TCE接触时间/d 临床分型 病程/da ALT(U/L) IgG/(g/L) ANA 1 慢性期患者 20 男 41 重症多形红斑 39 53.0 7.41 阴性 2 慢性期患者 49 男 54 重症多形红斑 50 46.0 5.39 阴性 3 慢性期患者 43 男 25 大疱性表皮松 18 19.0 7.93 阴性 4 慢性期患者 35 女 23 重症多形红斑 59 42.0 9.62 阴性 5 慢性期患者 24 男 30 重症多形红斑 71 227.0 5.90 阴性 6 慢性期患者 18 女 30 重症多形红斑 60 59.0 8.78 阴性 7 慢性期患者 21 男 30 重症多形红斑 47 44.0 7.61 阴性 8 慢性期患者 48 男 31 重症多形红斑 54 32.0 5.81 阴性 9 慢性期患者 17 男 31 重症多形红斑 61 274.0 4.74 阴性 10 慢性期患者 20 男 29 重症多形红斑 18 223.0 11.62 阴性 11 治愈者 18 女 30 重症多形红斑 601 10.0 8.53 阳性c 12 治愈者 21 男 30 重症多形红斑 259 6.0 40.38 阳性c 13 治愈者 24 男 37 多形红斑 104 88.0 8.29 阴性 14 治愈者 19 男 26 多形红斑 123 10.0 6.77 阳性c 15 治愈者 29 女 38 多形红斑 925 11.0 11.84 阴性 [注]a慢性期患者为采血时的病程，治愈者为痊愈时间；b重症多形红斑患者在后续治疗期间进展为大疱性表皮松解症；c滴度为1：100 
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