Determination by UV spectrophotometry of acetylcholine bromide content in test-strip for measuring whole blood cholinesterase activity
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+ English摘要:目的
建立紫外分光光度法测定全血胆碱酯酶活性测定试纸（简称测酶试纸）中溴化乙酰胆碱含量的方法，并验证该方法的可行性。
方法利用溴化乙酰胆碱和溴百里香酚蓝（测酶试纸的两种主要成分）的溶解性差异，将测酶试纸中的溴化乙酰胆碱洗脱下来，以浓度为2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mmol/L的溴化乙酰胆碱对照品溶液制作测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量测定方法的标准曲线，并对该法的标准曲线线性、准确度、精密度、耐用性及回收率进行验证。
结果该方法的标准曲线线性良好，线性相关系数的平均值为0.999 79。该法的准确度、精密度和耐用性良好，批内和批间相对标准偏差均不超过4%，加样回收率在94.90%~106.22%之间。
结论该方法可用于测定测酶试纸中溴化乙酰胆碱的含量。
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我国是一个农业大国，有机磷农药是我国使用广泛且用量最大的一类杀虫剂。但由于各种原因，有机磷农药中毒事件屡屡发生，且中毒患者病死率达10%以上[1-4]。有机磷农药是一类化学结构中含有磷元素的有机化合物，也被称为有机磷毒物。有机磷农药可以经不同途径进入人体，抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致乙酰胆碱蓄积而产生以神经功能紊乱为主的一系列中毒症状[5-6]。乙酰胆碱酯酶活性测定被认为是诊断有机磷中毒简单而确切的方法，也是判断中毒程度、指导抗毒药物应用、观察疗效和估计预后的重要指标[5-8]。
全血胆碱酯酶活性测定试纸（简称测酶试纸）是用于有机磷毒物中毒患者快速诊断和中毒严重程度分级的一种试纸，能快速检测人外周血胆碱酯酶活性，其主要成分为溴化乙酰胆碱。单位面积测酶试纸中溴化乙酰胆碱的含量与其检测性能密切相关。因此，为了准确测定测酶试纸中溴化乙酰胆碱的含量，拟参照《中华人民共和国药典》中O-乙酰基测定法[9]，建立测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量测定的紫外分光光度法，以期为测酶试纸质量检测提供一种操作简便、快速、准确且经济实用的方法。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
主要试剂：溴化乙酰胆碱、盐酸羟胺、盐酸、三氯化铁、无水乙醚、冰醋酸，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自西陇化工股份有限公司。
主要仪器：UV-4802型紫外分光光度计，购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；电子天平，购自赛多利斯科学仪器北京有限公司。
测酶试纸：将新华1号滤纸浸入含有溴化乙酰胆碱（0.057 mol/L）和溴百里香酚蓝（0.011 mol/L）的乙醇溶液（pH值为7.7）中，使其完全浸透，然后取出并挤出多余溶液，悬挂室内，在阴干后装入铝塑薄膜袋中并密封保存。阴干后的试纸为深黄色。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂配制
标准溶液储备液和标准溶液工作液的配制：精确称取溴化乙酰胆碱316.55 mg，用双蒸水定容至10 mL，配制成140 mmol/L的标准储备液，4 ℃保存。使用时用双蒸水将储备液制备成2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mmol/L系列浓度。测定时，取200 μL加双蒸水补足至1 mL，等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱分别为0.56、1.12、1.68、2.24和2.80 μmol/3 cm2。
其他溶液的配制：（1）2 mol/L盐酸羟胺溶液：精确称取盐酸羟胺20.85 g，加双蒸水定容至150 mL，混匀；（2）3.5 mol/L氢氧化钠溶液：精确称取氢氧化钠21.00 g，加双蒸水定容至150 mL混匀；（3）2 mol/L盐酸溶液：取浓盐酸（12 mol/L）36 mL，加双蒸水180 mL混匀；（4）0.1 mol/L盐酸溶液：取浓盐酸（12 mol/L）1.5 mL，加双蒸水178.5 mL混匀；（5）含三氯化铁质量分数为5.33%的水溶液：精确称取三氯化铁3.198 g，用0.1 mol/L盐酸定容至60 mL，混匀；（6）碱羟胺溶液：取2 mol/L盐酸羟胺溶液与3.5 mol/L氢氧化钠溶液以1:1混合，现用现配；（7）含乙酸体积分数为36%的水溶液：精确量取3.6 mL乙酸加6.4 mL双蒸水，混匀。
1.2.2 最大吸收波长的检测
分别取200 μL 2.8、5.6、8.4、11.2、14.0 mmol/L系列浓度的溴化乙酰胆碱标准工作液于10 mL离心管中，加双蒸水补足至1 mL，即各试管分别加入0.56、1.12、1.68、2.24、2.80 μmol溴化乙酰胆碱（等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱分别为0.56、1.12、1.68、2.24和2.80 μmol/3 cm2，3 cm2是用于乙酰胆碱测定的试纸表面积），加碱羟胺溶液2 mL混匀，室温放置5 min后加2 mol/L盐酸溶液2 mL混匀，最后加配制好的三氯化铁溶液3 mL呈色，呈色后过滤（滤除加入三氯化铁后生成的絮状物）[9]。用空白对照法，将UV-4802紫外分光光度计调零后，在400 ~ 900 nm范围内对过滤后溶液进行扫描，确定最大吸收波长。
1.2.3 标准曲线的绘制及其精密度与准确度试验
按照1.2.2所述方法进行检测，在确定的最大吸收波长下测定吸光度，空白管用双蒸水代替，余均同法处理。用OriginPro软件对最大吸收波长处测得的系列浓度的溴化乙酰胆碱的吸光度进行分析，以溴化乙酰胆碱的加样量为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），溴化乙酰胆碱加样量的线性拟合计算公式为：x =（y - b）/a，其中，b为标准曲线的截距，a为标准曲线的斜率。标准曲线分3 d、3个批次进行检测，测定其精密度与准确度，计算相对标准偏差（RSD）。
1.2.4 批内精密度与准确度试验
取浓度为5.6、8.4、11.2 mmol/L（等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱分别为1.12、1.68、2.24 μmol/3 cm2）的3个样品，每个浓度设置6个平行样品，在同一批次内进行测定，代入标准曲线方程, 计算实际浓度，并计算RSD。
1.2.5 批间精密度与准确度试验
取浓度为5.6、8.4、11.2 mmol/L（等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱分别为1.12、1.68、2.24 μmol/3 cm2）的3个样品，每个浓度设置6个平行样品，在3 d、3个独立的分析批次中进行测定，代入标准曲线方程计算实际浓度，并计算RSD。
1.2.6 加样回收试验
精确配制22.0、32.0和42.0 mmol/L的溴化乙酰胆碱溶液，分别取50 μL加至新华滤纸（普通型）上，即滤纸分别含1.1、1.6和2.1 μmol/3 cm2溴化乙酰胆碱，待晾干后加双蒸水0.9 mL，以配制好的乙酸溶液0.1 mL混匀，加无过氧化物的无水乙醚2 mL，振摇，用滴管吸去乙醚再用同量乙醚抽提3次（将溴香草酚蓝完全去除）；将试管置于37 ℃的水中水浴10 min蒸去乙醚，加碱羟胺溶液2 mL混匀，作用5 min后，加2 mol/L盐酸2 mL混匀，加配制好的三氯化铁溶液3 mL呈色，呈色后过滤，在确定的最大吸收波长下测定吸光度。每个浓度设置5个平行样品，计算回收率、平均回收率和RSD。
1.2.7 耐用性（稳定性试验）
浓度为22.0 mmol/L的3个平行样品于加样完成后0、10、20、40、60 min进行比色，对放置不同时间的样品进行测定，计算RSD。
2. 结果
2.1 波长检测
紫外分光光度计扫描结果显示，溴化乙酰胆碱标准曲线系列样品的最大吸收波长均为500 nm。因此，确定500 nm为测定溴化乙酰胆碱含量的检测波长。
2.2 标准曲线绘制
以溴化乙酰胆碱含量为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），通过线性回归求得的3条标准曲线方程分别为：y1 = 0.137 25 x1 - 0.004 86[R = 0.999 60，图 1（A）]，y2 = 0.132 64 x2 + 0.079 15[R = 0.999 82，图 1（B）]，y3 = 0.142 45 x3+ 0.007 29[R = 0.999 96，图 1（C）]；以上数据表明溴化乙酰胆碱在0.56 ~ 2.80 μmol/3 cm2范围内其浓度与吸光度呈现良好的线性关系（线性相关系数的平均值为0.999 79），该方法的最低定量限为0.56 μmol/3 cm2。
2.3 标准曲线系列样品的精密度与准确度验证
标准曲线系列样品的精密度与准确度试验检测结果见表 1。标准曲线系列样品的相对标准偏差为0.11% ~ 0.97%，相对误差为- 0.87% ~ 0.53%。
表 1 标准曲线系列样品批间精密度与准确度验证结果溴化乙酰胆碱标准曲线系列含量/ (μmol/3cm2) 溴化乙酰胆碱测定值/(μmol/3 cm2) RSD/% 相对误差/%a 1 2 3 均值 标准差 0.56 0.567 0.557 0.557 0.560 3 0.005 4 0.97 0.05 1.12 1.099 1.113 1.118 1.1103 0.0100 0.90 -0.87 1.68 1.691 1.691 1.685 1.689 0 0.003 6 0.21 0.53 2.24 2.255 2.250 2.245 2.249 9 0.004 8 0.21 0.44 2.80 2.789 2.789 2.794 2.790 4 0.003 1 0.11 -0.34 [注] a相对误差=（测定值-理论值）/理论值× 100% 2.4 批内精密度与准确度验证结果
批内精密度与准确度试验检测结果见表 2。平行样品测定值的相对标准偏差为0.14% ~ 0.38%，平均值的相对误差为0.51% ~ 1.04%。
表 2 批内精密度与准确度验证结果理论值/（μmol/3 cm2） 溴化乙酰胆碱测定值（/ μmol/3 cm2） RSD/% 相对误差/% 1 2 3 4 5 6 平均值 标准差 1.12 1.138 1.130 1.129 1.126 1.126 1.129 1.129 6 0.004 3 0.38 0.86 1.68 1.700 1.696 1.691 1.695 1.701 1.702 1.697 5 0.004 3 0.26 1.04 2.24 2.250 2.250 2.252 2.247 2.255 2.254 2.251 4 0.003 1 0.14 0.51 2.5 批间精密度与准确度验证结果
批间精密度与准确度试验检测结果见表 3。标准曲线平行样品测定值的相对标准偏差为0.80% ~ 3.66%，平均值的相对误差为- 2.25% ~ - 0.53%。
表 3 批间精密度与准确度验证结果理论值/（μmol/3 cm2） 批次 溴化乙酰胆碱测定值（/ μmol/3 cm2） RSD/% 相对误差/% 1 2 3 4 5 6 平均值 标准差 1.12 1 1.138 1.130 1.129 1.126 1.126 1.129 1.094 8 0.040 3.66 -2.25 2 1.046 1.052 1.036 1.032 1.044 1.039 3 1.106 1.129 1.125 1.112 1.106 1.102 1.68 1 1.700 1.696 1.691 1.695 1.701 1.702 1.656 3 0.039 2.35 -1.41 2 1.608 1.602 1.603 1.602 1.610 1.614 3 1.661 1.665 1.672 1.665 1.662 1.665 2.24 1 2.250 2.250 2.252 2.247 2.255 2.254 2.228 2 0.018 0.80 -0.53 2 2.221 2.219 2.218 2.209 2.207 2.210 3 2.228 2.221 2.215 2.213 2.213 2.225 2.6 加样回收率试验结果
加样回收率试验结果见表 4。3个浓度所检测溴化乙酰胆碱的加样回收率分别为97.01%、99.60%和99.37%。
表 4 测酶试纸溴化乙酰胆碱含量检测法加样回收率检测结果理论值/（μmol/3 cm2） 溴化乙酰胆碱回收率/% 1 2 3 4 5 均值 标准差 1.1 96.25 96.25 97.51 97.51 97.51 97.01 0.69 1.6 94.90 99.25 106.22 98.38 99.25 99.60 4.11 2.1 97.51 99.50 98.84 98.84 102.16 99.37 1.72 2.7 耐用性验证（稳定性试验）
耐用性验证结果如表 5所示，加样完成后分别放置0、10、20、40、60 min开始比色，所得结果的RSD均不超过4%。
表 5 测酶试纸溴化乙酰胆碱含量检测法耐用性验证结果放置时间/min 溴化乙酰胆碱测定值/(μmol/3 cm2) RSD/% 1 2 3 均值 标准差 0 1.096 1.113 1.087 1.099 0.013 1.19 10 1.098 1.115 1.094 1.102 0.011 1.02 20 1.110 1.131 1.119 1.120 0.011 0.94 40 1.083 1.110 1.104 1.099 0.014 1.27 60 1.086 1.108 1.101 1.098 0.011 1.02 2.8 测酶试纸溴化乙酰胆碱含量检测、计算方法的简化
如结果2.2所述，三条标准曲线线性回归方程的截距趋近于零，因此考虑以浓度为14.0 mmol/L的溴化乙酰胆碱溶液为标准品，将测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量的计算公式简化为：测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量（μmol/3 cm2）=（样品吸光度/标准品吸光度）× 2.8（μmol/3 cm2）。对浓度为5.6、8.4和11.2 mmol/L[等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量分别为1.12、1.68、2.24（μmol/3 cm2）]的3批溴化乙酰胆碱样品，每批6个平行样品，采用简化公式进行计算，并将结果与标准曲线线性回归方程计算结果进行比较，计算两者的比值。结果如表 6所示，两种计算方法比值的相对偏差为2.21% ~ 4.16%，相对误差为- 1.95% ~ - 0.53%。
表 6 简化公式计算值与线性回归方程计算值比较溴化乙酰胆碱含量/(μmol/3 cm2) 溴化乙酰胆碱含量简化公式计算值/线性回归方程计算值(均值±标准差） RSD/% 相对误差/% 1.12 0.994 7 ±0.041 4 4.16 -0.53 1.68 0.985 2 ± 0.027 8 2.82 -1.48 2.24 0.980 5 ±0.021 6 2.21 -1.95 上述结果支持采用上述简化公式计算测酶试纸溴化乙酰胆碱含量。
3. 讨论
本试验建立了测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量检测的方法，结果表明在2.8 ~ 14.0 mmol/L（等同于测酶试纸中溴化乙酰胆碱含量0.56 ~ 2.80 μmol/3 cm2）的范围内线性关系良好，线性相关系数（R）的平均值为0.999 79，最低定量限值为0.56 μmol/3 cm2；标准曲线系列样品的精密度及准确度、样品的批间和批内精密度及准确度均满足相应要求；方法耐用性测定结果RSD均不超过4%；溴化乙酰胆碱加样回收率分别为97.01%、99.60%和99.37%。研究显示，各项验证结果均符合要求，该方法的定量限值为0.56 μmol/3 cm2。简化测量试验显示，与标准曲线线性回归方程计算结果进行比较，RSD为2.21% ~ 4.16%，相对误差为- 1.95% ~ - 0.53%。因此，该方法可用于全血胆碱酯酶活性测定试纸中溴化乙酰胆碱的含量测定，并支持采用简化公式计算测酶试纸溴化乙酰胆碱含量。
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表 1 标准曲线系列样品批间精密度与准确度验证结果
溴化乙酰胆碱标准曲线系列含量/ (μmol/3cm2) 溴化乙酰胆碱测定值/(μmol/3 cm2) RSD/% 相对误差/%a 1 2 3 均值 标准差 0.56 0.567 0.557 0.557 0.560 3 0.005 4 0.97 0.05 1.12 1.099 1.113 1.118 1.1103 0.0100 0.90 -0.87 1.68 1.691 1.691 1.685 1.689 0 0.003 6 0.21 0.53 2.24 2.255 2.250 2.245 2.249 9 0.004 8 0.21 0.44 2.80 2.789 2.789 2.794 2.790 4 0.003 1 0.11 -0.34 [注] a相对误差=（测定值-理论值）/理论值× 100% 
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表 2 批内精密度与准确度验证结果
理论值/（μmol/3 cm2） 溴化乙酰胆碱测定值（/ μmol/3 cm2） RSD/% 相对误差/% 1 2 3 4 5 6 平均值 标准差 1.12 1.138 1.130 1.129 1.126 1.126 1.129 1.129 6 0.004 3 0.38 0.86 1.68 1.700 1.696 1.691 1.695 1.701 1.702 1.697 5 0.004 3 0.26 1.04 2.24 2.250 2.250 2.252 2.247 2.255 2.254 2.251 4 0.003 1 0.14 0.51
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表 3 批间精密度与准确度验证结果
理论值/（μmol/3 cm2） 批次 溴化乙酰胆碱测定值（/ μmol/3 cm2） RSD/% 相对误差/% 1 2 3 4 5 6 平均值 标准差 1.12 1 1.138 1.130 1.129 1.126 1.126 1.129 1.094 8 0.040 3.66 -2.25 2 1.046 1.052 1.036 1.032 1.044 1.039 3 1.106 1.129 1.125 1.112 1.106 1.102 1.68 1 1.700 1.696 1.691 1.695 1.701 1.702 1.656 3 0.039 2.35 -1.41 2 1.608 1.602 1.603 1.602 1.610 1.614 3 1.661 1.665 1.672 1.665 1.662 1.665 2.24 1 2.250 2.250 2.252 2.247 2.255 2.254 2.228 2 0.018 0.80 -0.53 2 2.221 2.219 2.218 2.209 2.207 2.210 3 2.228 2.221 2.215 2.213 2.213 2.225
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表 4 测酶试纸溴化乙酰胆碱含量检测法加样回收率检测结果
理论值/（μmol/3 cm2） 溴化乙酰胆碱回收率/% 1 2 3 4 5 均值 标准差 1.1 96.25 96.25 97.51 97.51 97.51 97.01 0.69 1.6 94.90 99.25 106.22 98.38 99.25 99.60 4.11 2.1 97.51 99.50 98.84 98.84 102.16 99.37 1.72
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表 5 测酶试纸溴化乙酰胆碱含量检测法耐用性验证结果
放置时间/min 溴化乙酰胆碱测定值/(μmol/3 cm2) RSD/% 1 2 3 均值 标准差 0 1.096 1.113 1.087 1.099 0.013 1.19 10 1.098 1.115 1.094 1.102 0.011 1.02 20 1.110 1.131 1.119 1.120 0.011 0.94 40 1.083 1.110 1.104 1.099 0.014 1.27 60 1.086 1.108 1.101 1.098 0.011 1.02
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表 6 简化公式计算值与线性回归方程计算值比较
溴化乙酰胆碱含量/(μmol/3 cm2) 溴化乙酰胆碱含量简化公式计算值/线性回归方程计算值(均值±标准差） RSD/% 相对误差/% 1.12 0.994 7 ±0.041 4 4.16 -0.53 1.68 0.985 2 ± 0.027 8 2.82 -1.48 2.24 0.980 5 ±0.021 6 2.21 -1.95
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