Feasibility study of multi-slice spiral CT in observing the curative effect of silicosis animal model
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+ English摘要:目的
探讨采用多层螺旋CT（multi-slice spiral CT，MSCT）观察大鼠矽肺模型疗效的可行性。
方法将60只无特定病原级SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组3组，每组各20只，分别进行MSCT检查及病理检查。根据各个肺窗的小阴影密集度拟定大鼠矽肺模型MSCT分级，统计所有大鼠矽肺模型MSCT级别的例数。通过观察肺组织病理学改变，进行大鼠矽肺病理分级。不同组别大鼠矽肺模型MSCT分级、病理分级统计均采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）；大鼠矽肺模型MSCT分级与病理分级的一致性采用加权Kappa一致性检验。
结果不同组别大鼠矽肺模型MSCT分级（H=26.27，P < 0.01）及病理分级（H=38.86，P < 0.01）的分布差异均有统计学意义。大鼠矽肺模型MSCT分级与病理分级的一致性检验的加权Kappa值=0.706（P < 0.05），提示各组大鼠的矽肺模型MSCT分级与病理分级具有较高的一致性。
结论MSCT可观察大鼠矽肺模型的疾病状态发展，作为评估大鼠矽肺模型疗效的检查方法，具有一定的可行性。
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锰是人体必需的微量元素，是多种酶的组成成分和激活剂，参与脂类、碳水化合物的代谢，且为蛋白质、DNA、RNA合成所必需，具有维持骨骼正常发育、促进糖和脂肪代谢及抗氧化功能，此外锰影响生殖功能。但过量的锰接触又会造成对机体的损害，如生产过程中过量吸入锰烟及锰尘可引起职业性慢性锰中毒，早期主要表现为类神经症，继而出现锥体外系神经受损症状，肌张力增高，手指明显震颤，腱反射亢进，并有神经情绪改变，严重者锥体外系神经障碍恒定而突出，表现为帕金森病样症状；还可出现中毒性精神病的表现[1]。锰接触常见的检测指标有血锰、尿锰等，对唾液锰检测较少[2-6]。由于采集血液的创伤性及采集尿液的不便，使人群采样不易实施，而唾液采样简便，无创伤，易被普通人群接受。本文尝试对唾液锰的原子吸收检测方法进行研究, 为探究更简便的锰采样方法提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本来源
选取从事电焊作业的234名电焊工为接触组，选取年龄、工龄等基本特征与接触组相近但不接触锰的135名工人作为对照组。根据工人接触锰的时间加权平均浓度（CTWA）和锰的职业接触限值（0.15 mg/m3），对接触组进行分组：CTWA ≥ 0.15 mg/m3为高接触组，CTWA < 0.15 mg/m3为低接触组。高接触组平均年龄（34.36 ± 7.82）岁，低接触组平均年龄（35.27 ± 9.15）岁，对照组平均年龄（35.61 ± 9.41）岁，三组年龄比较，差异无统计学意义（F = 0.586，P > 0.05）；高接触组平均工龄（4.74 ± 4.21）年，低接触组平均工龄（4.24 ± 3.56）年，两组工龄比较，差异无统计学意义（t = - 0.939，P > 0.05）。对三组对象的唾液进行采集，作为本次研究的样品。
1.1.2 仪器与试剂
AAnalyst 800石墨炉原子吸收分光光度计（PerkinElmer公司），具有THGA原子化器系统、纵向塞曼效应校正装置和自动进样器；热解涂层石墨管（PerkinElmer公司）；锰空心阴极灯（PerkinElmer公司）；LDZ 4-0.8型离心机；LabTech EH 20B型电热板。锰标准溶液，编号GBW（E）080505，质量浓度1.000 g/L（上海市计量测试技术研究院）；硝酸，优级纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试验原理
样品经前处理后，在锰元素特定波长下，用石墨炉原子吸收光谱法测定锰含量[7]。
1.2.2 样品采集与前处理
1）唾液采集。工人漱口后，通过咀嚼棉签采集唾液样本约1.5 mL于离心管中，置于4 ℃冰箱中保存备检。2）前处理。将唾液取出恢复至室温，于离心机上2 000 r/min离心10 min（离心半径8.5 cm），吸取0.5 mL上清液于小烧杯中，加入2 mL硝酸，过夜。然后于电热板上120 ℃消解至近干，用体积分数0.2%的硝酸溶液定容至2 mL，摇匀，转移至石墨炉样品杯中，上机待测。同时以纯水经相同前处理过程后的硝酸溶液做样品空白。
1.2.3 仪器工作条件
灯电流：10 mA；波长：279.5 nm；狭缝：0.2 nm；进样量：20 μL。石墨炉升温程序见表 1。
表 1 石墨炉升温程序步骤 温度/C 坡升时间/s 保留时间/s 氩气流量/(mL/min) 1 110 1 30 250 2 130 15 30 250 3 1 100 10 20 250 4 1 900 0 3 0 5 2 450 1 3 250 1.2.4 分析步骤
1）标准曲线绘制。将锰标准溶液逐级稀释成20.00 μg/L的标准使用液（测定用标准母液），以体积分数1%的HNO3为标准空白，按设定浓度由仪器自动稀释成5、10、15、20 μg/L的标准系列，在上述条件下测定，仪器自动绘制标准曲线。2）样品测定。将消解好的样品转移至样品测定杯，按编号依次放置于样品盘中，样品的测定条件与标准曲线相同。
1.2.5 结果计算
按公式C = 4（c - c0）计算结果，式中：C为唾液样品中锰的质量浓度（μg/L）；c为样品测定质量浓度（μg/L）；c0为样品空白测定质量浓度（μg/L）。
1.2.6 统计学分析
采用EpiInfo 7.0进行数据录入，用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本的t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 石墨炉工作条件
2.1.1 灰化温度的选择
随机选取一名对照组工人的唾液，经前处理后转移至石墨炉样品杯中。固定原子化温度2 000 ℃，每次提高100 ℃灰化温度进行试验，结果见图 1。
2.1.2 原子化温度的选择
随机选取一名对照组工人的唾液，同样方法前处理后，固定灰化温度1 100 ℃，每次提高100 ℃原子化温度进行试验，结果见图 2。
2.2 方法线性及检出限
在锰质量浓度为0 ~ 20 μg/L的范围内，一次线性回归方程为Y = 0.015 87 x + 0.004 80，相关系数为0.999 2（P < 0.01）（Y为吸光度；x为锰质量浓度，单位μg/L）。特征浓度为5.4 pg/0.004 4 Abs。按DL = 3 Sb/s计算方法的检出限[Sb为11次（参照原子吸收光度计检定规程中检出限的计算）空白测量结果的标准差，s为标准曲线的斜率]，DL = 3 × 0.001 56/0.015 87，计算的检出限为0.29 μg/L。进样量为20 μL时，检出限为5.8 pg。
2.3 方法准确度
随机选取18份对照组工人唾液样品，并随机平分为三组（作为本底），离心机上2 000 r/min离心10 min（离心半径8.5 cm），吸取0.5 mL上清液于小烧杯中，三组分别加入20 μg/L的锰标准液0.5、1.0、1.5 mL，加入2 mL硝酸，过夜。然后于电热板上120 ℃消解至近干，用体积分数0.2%的硝酸溶液定容至2 mL，摇匀，转移至石墨炉样品杯中，做加标回收试验, 结果显示高中低三组加标浓度回收率在85% ~ 106%之间。见表 2。
表 2 加标回收率测定结果样品编号 本底值/ (μg/L) 加标值/ (μg/L) 加标测定值/ (μg/L) 回收率/% 1 6.8 5 11.2 88 2 7.8 5 12.7 98 3 8.1 5 12.6 90 4 8.4 5 13.1 94 5 5.5 5 10.3 96 6 2.2 5 7.3 102 7 5.6 10 14.6 90 8 4.7 10 13.2 85 9 9.8 10 18.7 89 10 6.6 10 15.6 90 11 7.6 10 17.1 95 12 8.9 10 17.8 89 13 5.2 15 19.5 95 14 5.3 15 19.2 93 15 4.7 15 19.6 99 16 4.2 15 17.4 88 17 10.2 15 26.1 106 18 5.6 15 19.5 93 2.4 方法精密度
随机选取三份对照组工人唾液样品，按2.3方法制备高、中、低浓度3个样品，分别测定6次，计算相对标准偏差，结果显示相对标准偏差为1.5% ~ 1.8%。见表 3。
表 3 三种样品精密度测定结果样品编号 测定值/(μg/L) 均值/(μg/L) RSD/% (低浓度组） 8.3 ~ 8.7 8.5 1.8 2(中浓度组） 17.3 ~ 18.1 17.6 1.5 3(高浓度组) 21.4 ~ 22.3 21.9 1.7 2.5 样品测定结果分析
113名低接触组工人唾液锰质量浓度范围为0.4 ~ 35.2 μg/L，均值（7.68 ± 6.98）μg/L；121名高接触组工人唾液锰质量浓度最低0.4 μg/L、最高76.0 μg/L，均值为（13.38 ± 15.36）μg/L。资料经方差齐性检验和正态性检验后呈正态分布且方差齐。两组均值比较，差异有统计学意义（t = - 5.70，P < 0.01）。
135名对照组唾液锰质量浓度最低0.4 μg/L、最高35.2 μg/L，均值为（7.65 ± 5.57）μg/L，234名接触组工人唾液锰质量浓度均值（10.63 ± 12.37）μg/L。资料经方差齐性检验和正态性检验后呈正态分布且方差齐。两组均值比较，差异有统计学意义（t = - 4.748，P < 0.01）。
3. 讨论
唾液样品前处理时，要特别注意器皿的清洁度，并且要选用优级纯硝酸，以降低本底值。在吸取离心后的上清液时要尤其注意不能吸入下面的沉淀，否则会使结果有较大的误差。样品加酸过夜后在电热板上消解，能得到较好的回收率（85% ~ 106%）。
本次试验显示，在锰质量浓度为0 ~ 20 μg/L范围内，该方法具有良好的线性。但超出此浓度范围曲线会有弯曲，因此如果遇高浓度样品，应稀释后测定。
原子吸收测定时灰化温度和原子化温度的选择是关键。为去除样品基体干扰，减少背景吸收，保证分析的重现性，应在分析元素不受损失的前提下采取比较高的灰化温度；在吸光度及峰形均满意的前提下，选择比较低的原子化温度。灰化温度在300 ℃时峰形拖尾比较严重，随着温度升高，峰形逐渐对称，在1 100 ℃时，峰形对称，且出峰时间较合适。原子化温度低时峰形比较矮胖，随着温度升高，在1 900 ℃时峰形较好，吸光度达到平台。综合考虑吸光度、峰形、峰高、出峰时间及石墨管寿命，选择灰化温度1 100 ℃为最佳灰化温度，原子化温度1 900 ℃为最佳原子化温度。为选择最佳的灰化和原子化温度，应做灰化温度图（见图 1）和原子化温度图（见图 2）。
试验使用热解涂层石墨管，致密性好、耐高温、记忆效应小，能很好地降低背景吸收，采用比较先进的仪器（THGA原子化器系统、纵向塞曼效应校正装置和自动进样器），不但操作简便，更使测定结果有较好的准确度和精密度。
从样品测定结果的统计分析来看，接触组工人唾液锰水平显著高于对照组，其中接触组中的高接触组工人唾液锰含量又显著高于低接触组，差异均有统计学意义（P < 0.01）, 提示唾液锰可能是锰接触工人接触水平较好的生物标志物。
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图 3 大鼠矽肺模型典型MSCT表现
[注]大鼠矽肺模型0级表现：双肺各叶肺纹理走行自然，未见异常密度影；大鼠矽肺模型1级表现：右肺中叶外侧段及左肺上叶下舌段散在少许小阴影（箭头所示），余肺未见异常密度影；大鼠矽肺模型2级表现：双肺各叶弥漫大量小阴影（箭头所指）；大鼠矽肺模型3级表现：双肺各叶弥漫大量小阴影（箭头所指），并见斑块影（三角形所指）形成
表 1 大鼠矽肺MSCT分级与病理分级比较
影像结果 病理检查结果 0级 1级 2级 3级 0级 3 8 0 0 1级 0 6 4 0 2级 0 0 8 2 3级 0 0 0 9 加权Kappa值 0.706 P值 < 0.05 
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