尘肺病是我国目前危害最严重和最常见的职业病。根据国家卫生健康委员会统计，截至2018年底，我国尘肺病例数已高达87万余例，占职业病总数近90% ^[1-2]。矽肺是尘肺病的主要病种，是由长期吸入大量游离二氧化硅（SiO₂）粉尘引起，以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病。目前对尘肺病的研究多以建立动物矽肺模型为主要方法^[3]。虽然矽肺的危害性大，但至今仍无有效的治疗方法，目前干细胞治疗矽肺模型成为研究新方向^[4]，而评估矽肺模型状态发展及治疗效果主要依赖于病理学检查^[5-6]。本研究旨在应用多层螺旋CT（multi-slice spiral CT，MSCT）观察大鼠矽肺模型影像学表现，将其与病理结果进行比较分析，以探讨MSCT在观察矽肺动物模型疗效中的可行性。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   大鼠

无特定病原体级健康雄性大鼠60只，体质量范围160 ~ 200 g，由广东省医学实验动物中心提供并实验，实验所用大鼠的许可证号：SYXK（粤）2013-0002。大鼠饲养条件符合《实验动物环境及设施》（GB 14925-2010）的相关要求。本研究经广东省医学实验动物中心实验动物伦理委员会批准。

1.1.2   仪器、细胞和试剂

SOMATOM Emotion 16排多层螺旋CT（德国西门子公司）；BX43型OLYMPUS生物显微镜（日本奥林巴斯公司）；AXIO Scopeal型光学显微镜（德国Carl Zeiss公司）；人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）（深圳市合一康生物科技股份有限公司）；质量分数0.9%生理盐水（浙江都邦药业股份有限公司）；游离SiO₂粉尘（纯度为99.00%，80.00%粒径为1 ~ 5 pm）（美国SIGMA公司）。用0.9%的生理盐水与游离SiO₂粉尘配制质量浓度为50 mg/mL的SiO₂混悬液，高压灭菌。

1.2   方法

1.2.1   大鼠分组与处理

从60只健康大鼠中随机挑选40只大鼠进行矽肺模型制作，随机分为模型组和治疗组，每组20只，余下的20只健康大鼠作为对照组在同时间内灌注等体积生理盐水。矽肺模型制作过程：将大鼠持续吸入乙醚麻醉后固定，再以体积分数75.00%的乙醇消毒颈部皮肤，沿颈正中线作5 ~ 7 mm切口，钝性分离肌肉、暴露气管，然后向大鼠气管内灌注0.5 mL SiO₂混悬液，注入后立即左右晃动，使大鼠尽快苏醒，苏醒后再次麻醉，缝合创口，放回笼内。间隔7 d再次染尘造模，方法同上。治疗组20只大鼠于首次造模后4周进行尾静脉注射hUC-MSCs，细胞密度3 × 10⁶个/mL，0.5 mL/只；模型组大鼠同时间注射等体积的生理盐水。

1.2.2   MSCT检查

各组大鼠于首次染尘后60 d进行MSCT扫描。扫描前受检大鼠禁食8 h，禁水4 h，以体积分数3.00%戊巴比妥钠（剂量为2 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后将受检大鼠正常体位用胶带固定于检查床，使其四肢伸展，肺部充分暴露。使用SOMATOM Emotion 16排多层螺旋CT进行扫描，扫描参数为：电压130 kV，电流150 mA，采用1.2 mm层厚无间隔重建高分辨率CT图像。

1.2.3   MSCT扫描图像分析

主要参照国内外相关文献报道^[7-9]的分析方法，由3名具有主治医师以上职称的放射诊断医师共同阅片讨论，通过连续观察大鼠各个肺窗的小阴影拟定大鼠矽肺模型矽肺MSCT分级。具体分级标准：0级指大鼠各个肺窗肺野清晰，肺纹理走行自然，未见异常密度影；1级指大鼠部分肺窗或全部肺窗出现少量小阴影（即小阴影分布面积占同平面肺窗面积1% ~ 20%），未见间质纤维化；2级指大鼠部分肺窗或全部肺窗出现大量小阴影（即小阴影分布面积占同平面肺窗面积21% ~ 40%），伴间质纤维化；3级指大鼠部分肺窗或全部肺窗出现大量小阴影，并具有一个以上的斑块影（由矽结节和间质纤维化融合而成）。见图 1。

图  1  大鼠矽肺MSCT分级

[注]图 1A：0级双侧肺窗清晰，双肺纹理走行自然，未见异常密度影；图 1B：1级双侧肺窗见少量小阴影，未见间质纤维化；图 1C：2级双侧肺窗见大量小阴影伴间质纤维化；图 1D：3级双侧肺窗见大量小阴影，并见纤维斑块形成

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1.2.4   病理组织学检查

各组大鼠于首次染尘后60 d进行MSCT检查后被处死，取各组大鼠的肺组织常规制作5 μm切片，行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光学显微镜下观察肺组织的形态学变化。通过观察肺组织病理学改变，进行大鼠矽肺病理分级。分级标准主要参考《职业性尘肺病的病理诊断标准》（GBZ 25-2014）^[10]、《关于实验性尘肺研究问题的访谈》^[11]，具体为：0级为正常肺组织；1级对应的是实验性尘肺病理标准Ⅰ级和Ⅱ级纤维化；2级对应的实验性尘肺病理标准Ⅲ级纤维化；3级对应实验性尘肺病理标准Ⅳ级纤维化。

1.2.5   统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。不同组别大鼠矽肺MSCT分级、病理分级均采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）；因为大鼠矽肺MSCT分级与病理分级结果为等级资料，故对其一致性检验用加权Kappa一致性检验。加权Kappa值的评价标准： < 0.20为极低一致性；0.21 ~ 0.40为一般一致性；0.41 ~ 0.60为中等一致性；0.61 ~ 0.80为较高一致性；0.81 ~ 1为高度一致性。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   病理组织学检查

对大鼠肺组织进行HE染色，观察肺组织病理学改变，个别大鼠矽肺模型病理切片表现见图 2。结果显示，对照组20只大鼠肺组织均无病理学改变，病理评级为0级。模型组大鼠矽肺病理评级：1级6只，表现为肺组织内炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织的1% ~ 20%；2级7只，表现为肺组织内炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织的21% ~ 40%；3级7只，表现为肺组织内炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织41% ~ 60%，且见矽性纤维形成。治疗组大鼠矽肺病理评级：0级3只，1级8只，2级5只，3级4只（肺组织内炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织的41% ~ 55%）。经Kruskal-Wallis检验，三组间病理分级分布差异有统计学意义（H = 38.86，P < 0.01）。

图  2  大鼠矽肺病理分级表现

[注]图 2A：光镜下正常肺组织肺泡间隔无增宽，未见炎性肉芽肿和矽结节；图 2B：光镜下病变肺组织肺泡间隔增宽（5% ~ 10%），炎性肉芽肿和矽结节（箭头所指）分布面积占切片肺组织面积的1% ~ 5%；图 2C：光镜下病变肺组织肺泡间隔增宽（10% ~ 15%），炎性肉芽肿和矽结节（箭头所指）分布面积占切片肺组织面积的21% ~ 25%；图 2D：光镜下病变肺组织肺泡间隔增宽（25% ~ 30%），炎性肉芽肿和矽结节（箭头所指）分布面积占切片肺组织面积的41% ~ 45%，并见矽性纤维化形成（△所指）

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2.2   MSCT影像表现

大鼠矽肺模型典型MSCT影像表现见图 3。阅片结果显示，对照组20只大鼠均为正常肺部影像学表现，矽肺MSCT评级均为0级。模型组大鼠肺部MSCT影像表现：0级4只，为正常肺部影像表现；1级4只，表现为肺窗内出现少量小阴影；2级6只，表现为肺窗内弥漫大量小阴影；3级6只，表现为肺窗内弥漫大量小阴影，并见斑块影形成。治疗组大鼠肺部MSCT影像表现：0级7只，1级6只，2级4只，3级3只。经Kruskal-Wallis检验，三组间病理分级分布差异有统计学意义（H = 26.27，P < 0.01）。

图  3  大鼠矽肺模型典型MSCT表现

[注]大鼠矽肺模型0级表现：双肺各叶肺纹理走行自然，未见异常密度影；大鼠矽肺模型1级表现：右肺中叶外侧段及左肺上叶下舌段散在少许小阴影（箭头所示），余肺未见异常密度影；大鼠矽肺模型2级表现：双肺各叶弥漫大量小阴影（箭头所指）；大鼠矽肺模型3级表现：双肺各叶弥漫大量小阴影（箭头所指），并见斑块影（三角形所指）形成

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2.3   大鼠矽肺MSCT分级与病理分级比较

对大鼠矽肺模型MSCT分级与病理分级进行一致性分析，加权Kappa值约等于0.706，提示具有较高的一致性，见表 1。

表  1  大鼠矽肺MSCT分级与病理分级比较

影像结果	病理检查结果
	0级	1级	2级	3级
0级	3	8	0	0
1级	0	6	4	0
2级	0	0	8	2
3级	0	0	0	9
加权Kappa值	0.706
P值	< 0.05

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3.   讨论

本研究从60只大鼠中随机选取40只大鼠建立矽肺模型，且建模成功。但我们也发现，即使严格按照操作流程，采用通用的造模方法，组内个体之间发展程度仍存在着较大差异，考虑这可能与每只健康大鼠自身肺净化能力不同有关。由于大鼠矽肺模型发展程度的不一致以及治疗效果的个体差异性，在评估大鼠矽肺模型治疗疗效时，需要科学评估其处于矽肺发展的具体阶段。目前，动物矽肺模型治疗疗效评估主要依赖于病理学检查，然而制作动物模型病理切片需要处死实验动物，无法对同一个体的治疗过程进行动态观察研究，而临床上评估肺部疾病转归主要依据影像学检查，尤其是采用MSCT^[12-15]。随着CT设备更新迭代，MSCT在肺部疾病的检查上具有相当大的优势^[16]。MSCT检查不仅图像分辨率高、扫描速度快，而且可以对病变部位多平面重建及多方位观察，能够更准确、直观地观察细小病灶^[17-18]。本研究旨在制定大鼠矽肺模型MSCT分级标准，通过一致性比较，来评估MSCT的应用价值。

为了科学、有效评估大鼠矽肺模型的病理状况及MSCT表现，笔者参考了国内外文献的研究方法，综合了我国实验性尘肺病理分级标准和《职业性尘肺病的病理诊断标准》（GBZ 25-2014）中的分级标准，以及人类矽肺的病变特点：（1）壹期矽肺：病理检查可见少量的炎性肉芽肿和矽结节，CT检查部分或全部肺窗内可见少量小阴影；（2）贰期矽肺：病理检查可见较多炎性肉芽肿和矽结节，CT检查部分或全部肺窗内见较多小阴影；（3）叁期矽肺：病理检查可见炎性肉芽肿、矽结节和矽性纤维，CT检查部分或全部肺窗内可见大量小阴影和斑块影。结合以上信息，拟定了大鼠矽肺模型矽肺MSCT分级。由于MSCT肺窗内显示的小阴影比较细小，诊断过程中存在着较大的个人主观意识，所以本研究邀请了3名具有主治医师以上资格的放射诊断医师阅片并共同商讨以评定大鼠矽肺模型MSCT分级。在病理分级方面，我国的实验性尘肺的病理分级标准是在参考英国学者King氏（1953）矽结节病理分级标准的基础上按我国的实际情况研制后提出的四级分类法^[11]，分别为Ⅰ ~ Ⅳ级，各级的分级标准多采用“个别”“少量”“一定量”等词语描述，缺少具体的量化标准；而《职业性尘肺病的病理诊断标准》（GBZ 25-2014）中尘性弥漫性纤维化的分级分为3级，且按照病变占全肺面积的比例（25%、50%、75%）进行量化。本研究将实验性尘肺的病理分级中Ⅰ、Ⅱ级纤维化标准定为大鼠矽肺病理分级1级，Ⅲ级纤维化定为2级，Ⅳ级纤维化定为3级，分析读片结果，发现1级纤维化中炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织的1% ~ 20%；2级纤维化中炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片肺组织的21% ~ 40%；3级纤维化中炎性肉芽肿和矽结节的分布面积占切片肺组织的40%以上，并见矽性纤维化形成。提示，可考虑通过观察大鼠矽肺模型炎性肉芽肿和矽结节分布面积占切片面积比例来确定实验性尘肺的病理分级。

经过分析比较，本次建模的40只大鼠的矽肺MSCT分级与病理分级具有较高的一致性（加权Kappa = 0.706），提示MSCT可观察大鼠矽肺模型的疾病状态发展，作为评估大鼠矽肺模型疗效的检查方法，具有一定的可行性。由于本次研究中大鼠矽肺模型样本量较少，其统计结果有一定的局限性，数据可靠性仍需进一步扩大样本量进行检验。