三氯乙烯（trichloroet hylene，TCE）是一种常用的有机溶剂，广泛用于电子、五金、电镀板清洗等行业，少数接触者会出现发热、皮疹、肝功能损害，严重者出现继发感染致多器官功能衰竭而死亡，因其临床表现、发病特点与药疹样皮炎患者极为相似，国家职业卫生标准《职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准》（GBZ 185-2006）^[1]将其命名为“职业性TCE药疹样皮炎”（occupational medicamentosa-like dermatitis due to trichloroethylene，OMLDT）。自1988年广东省发现首例由TCE所致的严重剥脱性皮炎患者至今，已经发现500多例由TCE引起的严重皮肤损害病例^[2-4]。由于起病急、易误诊、病死率高，OMLDT已成为TCE接触工人健康危害的突出问题。OMLDT的发病机制目前尚不十分清楚。多年来，我国大部分学者认为该疾病属于Ⅳ型变态反应，但有关TCE免疫性损伤的调节机制研究还刚起步，有研究者^[5]通过流式细胞术检测发现，TCE致敏小鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Tregs）的比例发生了明显变化，表现为“先短期升高后下降”，提示CD4⁺CD25⁺Tregs细胞在TCE致接触过敏性皮炎的发生过程中发挥着免疫下调作用。因目前尚无OMLDT患者的调节性B细胞（Bregs）检测的相关报道，故本研究对OMLDT患者外周血CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs进行了检测及动态观察，希望通过对患者免疫调节细胞功能状态的研究，为该病的免疫学发病机制提供线索。

1.   对象与方法

1.1   对象

选择深圳市职业病防治院确诊为OMLDT的15例住院患者（其中，多形红斑7例，重症多形红斑8例）作为实验组，同时按年龄、性别匹配，选取15例正常人设为对照组。纳入标准：OMLDT患者和健康体检者均无影响造血和免疫功能的基础疾患、首次就诊3个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、无癌症史、放疗及化疗史、无其他骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。所有参与者均需签订知情同意书。本课题已通过深圳市职业病防治院医学伦理委员会审核批准。

1.2   方法

1.2.1   血样采集

15名患者均在入院1 d内[急性期（设为急性期组），距发病4 ~ 30 d，平均（13.20 ± 7.90）d]，于清晨空腹状态下取外周静脉血5 mL，EDTA抗凝。患者入院后均使用足量的糖皮质激素为主要治疗措施的综合免疫抑制治疗，初始剂量为静脉注射甲泼尼松300 ~ 1 000 mg/d，根据体温、皮疹、肝功能等变化逐渐减量至停用，甲泼尼松总用量为（12 095.47 ± 8 152.03）mg。经治疗，患者皮疹消退，各脏器指标均恢复正常，并于停用激素及影响免疫功能的药物后定为临床治愈期（设为临床治愈组），距发病62 ~ 330 d，平均（130.73 ± 83.17）d，停用激素均在1周内，与上法相同采集血样送检。对照组血样采集同实验组。

1.2.2   外周血CD4⁺CD25⁺Tregs水平检测

应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血CD4⁺CD25⁺Tregs水平。取EDTA抗凝外周静脉血100 μL，置于流式检测管中，分别加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的鼠抗人CD4抗体12 μL和巯基化藻红蛋白（phycocrthrin，PE）标记的鼠抗人CD25抗体12 μL，CD8-cy5-PE抗体12 μL。另外，以FITC标记的鼠抗人CD4抗体12 μL和PE标记的鼠抗人同型阴性Y1对照抗体12 μL为阴性对照管，充分混匀各管，4 ℃暗室孵育30 min后，每管各加本实验室配制的溶血素3 000 μL，充分打匀后置室温孵育12 min，离心5 min（1 000 r/min，离心半径为10 cm），弃上清加鞘液500 μL，用BD FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）检测，Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异阴性对照值。以CD4⁺CD25⁺Tregs占外周血CD4⁺T细胞的比例来评价CD4⁺CD25⁺Tregs的表达水平。

1.2.3   外周血CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs水平检测

患者或健康人EDTA抗凝外周静脉血2 mL，取全血200 μL，每个试管分别加入抗体20 μL（CD19\CD24\CD27），再取一管中加入3种不同抗体，混匀，加入红细胞裂解液（Lysing Buffer 1 × 10倍稀释）2 mL，用振荡器混匀，避光孵育15 ~ 20 min，再加入2 mL红细胞裂解液，再次避光孵育15 min，37 ℃水浴箱裂解红细胞。以200的相对离心力离心5 min，倒掉上清液，留一圈白细胞，再加上2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），避光操作，再次离心，然后再加入0.5 mL PBS冲洗，如果试管中可见红细胞多的话，可再加入0.5 mL PBS液，离心收集细胞。操作按试剂盒说明书进行，采用BD FACSCalibur流式细胞仪检测，Cellquest软件分析数据，结果以CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs占B淋巴细胞的百分比（%）表示。

1.2.4   统计学分析

应用SPSS 18.0软件包进行统计分析，所有统计结果以均数±标准差（$\bar{x}\pm s$）表示。急性期组、临床治愈组、健康对照组各指标总体比较使用one-way ANOVA分析法，急性期组和临床治愈组各指标分别与健康对照组两两比较采用LSD检验，急性期组与临床治愈组各指标比较采用配对t检验。实验组不同临床类型指标比较采用独立样本t检验。实验组急性期CD4⁺CD25⁺Tregs比例与肝功能指标的相关性分析使用Pearson相关性检验。所有检验均为双侧，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   各组的检测结果比较

OMLDT急性期组CD4⁺CD25⁺Tregs比例低于健康对照组和临床治愈组，差异有统计学意义（P < 0.01）；临床治愈组低于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。

OMLDT急性期组CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs比例低于健康对照组和临床治愈组，差异具有统计学意义（P < 0.01）。临床治愈组与健康对照组相比，差异无统计学意义（P> 0.05）。见表 1。

表  1  CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs的检测结果

分组	样本例数	CD4+CD25+Tregs/%	CD19+CD24+CD27+Bregs/%
健康对照组	15	4.93 ± 0.96	26.25 ± 9.14
临床治愈组	15	2.54 ± 0.42	23.28 ± 8.62
急性期组	15	0.99 ± 0.55	7.86 ± 2.35
t值a		-8.76	-0.92
t值b		-13.68	-7.53
t值c		-8.75	-6.67
注：a临床治愈组与健康对照组比较，独立样本t检验；b急性期组与健康对照组比较，独立样本t检验；c临床治愈组与急性期组比较，配对t检验

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   不同临床类型OMLDT结果比较

OMLDT患者按临床类型可分为多形红斑型和重症多形红斑型，急性期和临床治愈期两组临床类型的CD4⁺CD25⁺Treg及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs水平差异均无统计学意义（P> 0.05）。见表 2。

表  2  不同临床类型CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs比较

分组	临床类型	样本例数	CD4+CD25+ Tregs/%	CD19+CD24+ CD27+Bregs/%
急性期	多形红斑	7	0.97 ± 0.59	8.89 ± 3.11
	重症多形红斑	8	1.02 ± 0.55	7.00 ± 0.94
	t值		-0.152	1.640
	P值		0.881	0.124
临床治愈期	多形红斑	7	2.46 ± 0.41	21.88 ± 11.24
	重症多形红斑	8	2.63 ± 0.44	24.51 ± 6.05
	t值		-0.726	-0.576
	P值		0.481	0.574

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   CD4⁺CD25⁺Tregs与CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs相关性分析

OMLDT患者急性期和临床治愈期患者CD4⁺CD25⁺Tregs与CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs均无相关关系（P> 0.05）。见表 3。

表  3  CD4⁺CD25⁺Tregs与CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs相关性

分组	CD4+ CD25+ Tregs /%	CD19+CD24+ CD27+Bregs/%	相关系数r	P值
急性期	0.99 ± 0.55	7.86 ± 2.35	0.511	0.052
临床治愈期	2.54 ± 0.42	23.28 ± 8.62	0.439	0.101

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

大多观点认为OMLDT的发病机制是T淋巴细胞介导的IV型变态反应。对OMLDT中炎症反应的发生机制有大量的研究，但有关TCE免疫性损伤的调节机制研究还刚起步。CD4⁺CD25⁺Tregs是近些年来免疫学研究中的一个热点。Sakaguchi等^[6]在研究小鼠自身免疫性疾病时，首次在未免疫小鼠的外周血中发现了CD4⁺CD25⁺Tregs，并证明该细胞为一种免疫调节性T细胞。目前，Tregs发挥免疫抑制作用的机制尚未完全阐明，迄今为止学者已经提出了以下4种不同机制^[7]：（1）通过分泌转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、白细胞介素（interleukin，IL）-10以及IL-35等免疫抑制性细胞因子发挥作用；（2）通过分泌穿孔素与颗粒酶A，对活化的效应T细胞发挥直接细胞毒性作用；（3）通过细胞表面免疫抑制分子，如细胞毒性T淋巴细胞抗原（cytotoxic T 1ymphocyte-associated protein，CTLA）4与Fas配体，使效应T细胞失活；（4）Tregs与效应CD4⁺ T细胞、抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）之间的相互作用抑制免疫应答。Tregs对维持外周免疫耐受至关重要，其数量或者功能缺陷在自身免疫性疾病的发生、发展中发挥重要作用。

江涛等^[5]通过流式细胞术检测了BALB/c小鼠脾脏组织中CD4⁺CD25⁺Tregs细胞所占CD4⁺细胞的百分比，研究结果显示，TCE致敏小鼠体内Tregs的动态变化，总体上呈现“先升高后下降”的趋势，提示Tregs可能在TCE致敏过程中发挥了重要的作用。本研究显示15例OMLDT患者急性期组的外周血中CD4⁺CD25⁺Tregs比例明显低于健康对照组（P < 0.01），而且当患者达到临床治愈期时患者的外周血中CD4⁺CD25⁺Tregs比例明显较急性期时升高（P < 0.01），但还是低于同期的健康对照者的外周血中CD4⁺CD25⁺Tregs比例（P < 0.01）。与动物实验结果不同的是，OMLDT患者急性期即表现为外周血CD4⁺CD25⁺Tregs比例的显著降低，并不表现出先升高后降低的现象，这种不同可能与OMLDT患者发病时大多距离接触三氯乙烯的时间超过2周有关，他们一般在接触4周后发病，表现为发热、皮疹及程度不一的肝功能损害。这种发病时表现为CD4⁺CD25⁺Tregs明显减少与某些自身免疫性疾病如类风湿关节炎^[8]、活动期系统性红斑狼疮^[9]及免疫性血小板减少性紫癜的外周血CD4⁺CD25⁺Tregs减少^[10]相似。CD4⁺CD25⁺Tregs被称为“职业”抑制细胞。在自身免疫反应过程中，通过抑制反应性T细胞和B细胞的活化以及细胞因子的产生，起到防止自身免疫疾病发生的作用。因此，OMLDT患者急性期外周血CD4⁺CD25⁺Tregs减少表明三氯乙烯对机体的作用抑制了CD4⁺CD25⁺Tregs的增殖，导致其数量减少；Tregs减少对单核细胞或巨噬细胞免疫抑制作用减弱，引起炎性反应状态，使机体对三氯乙烯激活的T细胞活化抑制作用减弱，因此，造成患者出现类似自身免疫反应的组织细胞损害。

近年有发现有一群特异的、具有抑制功能的B淋巴细胞参与负向免疫调节，这群B淋巴细胞被命名为调节性B细胞（Bregs），它们在变态反应性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、感染以及移植等免疫相关性疾病中发挥着重要作用。调节性B细胞通过分泌IL-10和TGF-β发挥免疫调节作用。这些细胞的缺失或功能失调会导致炎症和自身免疫性疾病的恶化^[11]，其中产生IL-10的Bregs被称为B10细胞，是这种细胞因子的主要来源。有研究提示人类B10细胞不局限于一个亚群，人B10细胞能够产生IL-10的细胞包括CD24hiCD38hi和CD24hiCD27⁺ B细胞。已有体外实验表明，IL-10对于Tregs的分化起促进作用。如果Bregs功能减弱或缺失则可引起多种自身免疫病^[12-13]。本次研究结果显示，15例OMLDT患者急性期组的外周血中CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs比例明显低于健康对照组（P < 0.01），随着患者达到临床治愈期，此时患者的外周血中CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs明显较急性期时升高（P < 0.01），而且与同期的健康对照者的外周血中CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs相比，差异无统计学意义（P> 0.05）。

同时，我们分析比较了两种类型的OMLDT（多形红斑及重症多形红斑）的外周血CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs，结果显示CD4⁺CD25⁺Tregs和CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs无论是急性期还是临床治愈期，在两种皮炎类型患者之间差异均无统计学意义（P> 0.05），说明多形红斑及重症多形红斑两者病情严重程度尽管不同，但其发病时CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs的改变大致相近。本研究进一步分析了CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs的相关性，无论是在急性期还是临床治愈期，两者均无相关性（P> 0.05）。

通过大剂量糖皮质激素为基础的综合治疗，所有15例患者均达到临床痊愈，而且通过治疗，CD4⁺CD25⁺Tregs及CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs的比例治愈期时较急性期明显增加（P < 0.01），但是其调节性T细胞仍然低于健康对照者（P < 0.01）。这一现象表明，OMLDT患者的CD4⁺CD25⁺Tregs恢复缓慢，可能是部分患者并发银屑病这样的自身免疫性疾病的机制之一^[14]。

总之，本次实验表明，OMLDT患者在急性期不但CD4⁺CD25⁺Tregs比例明显减少，而且CD19⁺CD24⁺CD27⁺Bregs也明显减少。调节性B细胞发挥负向免疫调节作用主要是依赖其分泌IL-10和TGF-β来发挥负向调节作用；同时，可以促进效应性T细胞分化为Tregs。如果Bregs减少，相应地分泌IL-10减少，同时由于Tregs的同步减少，抑制炎症的细胞因子减少，这可能是导致OMLDT患者表现出明显的全身炎性反应综合征的免疫机制之一。本研究为将来开展以提高OMLDT患者体内的调节性B细胞及调节性T细胞比例，达到抑制过度的自身免疫损害的治疗，提供了理论依据；同时，也为将来在临床上减少糖皮质激素长期应用带来的各种并发症提供理论依据。

综上，本研究表明三氯乙烯药疹样皮炎患者存在调节性T细胞及调节性B细胞的比例减少，通过临床治疗后两者明显升高，提示三氯乙烯药疹样皮炎患者存在免疫调节的紊乱，这为临床寻找更好的治疗方案提供了科学依据。