Protective effect of hesperitin on silica-induced pulmonary oxidative injury in rats
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+ English摘要:目的
探讨橙皮素对染矽尘大鼠肺组织氧化损伤的保护作用。
方法将54只Wistar雄性大鼠随机分为阴性对照组，二氧化硅（SiO2）模型组，橙皮素低、中、高剂量治疗组及吡非尼酮阳性对照组，每组9只。阴性对照组经气管灌注1 mL生理盐水，其他各组均经气管灌注1 mL 50 mg/mL SiO2，24 h后对各组动物进行药物干预，每天灌胃给药1次。染尘28 d后处死大鼠，观察各组大鼠肺组织病理学改变，检测每组大鼠肺组织丙二醛（MDA）含量、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活力及总抗氧化能力（T-AOC）。
结果组织病理学结果显示，吡非尼酮阳性对照组及橙皮素治疗组大鼠肺组织的损伤程度减轻。与阴性对照组相比，SiO2模型组大鼠肺系数、MDA含量和SOD活力明显升高（P < 0.05），CAT、GSH-Px、T-AOC活力未出现明显变化（P > 0.05）；给予药物治疗后，吡非尼酮阳性对照组和橙皮素治疗组的大鼠肺系数、肺泡炎和纤维化评分及MDA含量均出现不同程度的降低（P < 0.05），CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC活力均出现不同程度的升高（P < 0.05）。
结论橙皮素可能通过改变各氧化指标水平，增强抗氧化能力，减轻SiO2对大鼠肺组织的损伤作用。
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锰是人体必需的微量元素，是多种酶的组成成分和激活剂，参与脂类、碳水化合物的代谢，且为蛋白质、DNA、RNA合成所必需，具有维持骨骼正常发育、促进糖和脂肪代谢及抗氧化功能，此外锰影响生殖功能。但过量的锰接触又会造成对机体的损害，如生产过程中过量吸入锰烟及锰尘可引起职业性慢性锰中毒，早期主要表现为类神经症，继而出现锥体外系神经受损症状，肌张力增高，手指明显震颤，腱反射亢进，并有神经情绪改变，严重者锥体外系神经障碍恒定而突出，表现为帕金森病样症状；还可出现中毒性精神病的表现[1]。锰接触常见的检测指标有血锰、尿锰等，对唾液锰检测较少[2-6]。由于采集血液的创伤性及采集尿液的不便，使人群采样不易实施，而唾液采样简便，无创伤，易被普通人群接受。本文尝试对唾液锰的原子吸收检测方法进行研究, 为探究更简便的锰采样方法提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本来源
选取从事电焊作业的234名电焊工为接触组，选取年龄、工龄等基本特征与接触组相近但不接触锰的135名工人作为对照组。根据工人接触锰的时间加权平均浓度（CTWA）和锰的职业接触限值（0.15 mg/m3），对接触组进行分组：CTWA ≥ 0.15 mg/m3为高接触组，CTWA < 0.15 mg/m3为低接触组。高接触组平均年龄（34.36 ± 7.82）岁，低接触组平均年龄（35.27 ± 9.15）岁，对照组平均年龄（35.61 ± 9.41）岁，三组年龄比较，差异无统计学意义（F = 0.586，P > 0.05）；高接触组平均工龄（4.74 ± 4.21）年，低接触组平均工龄（4.24 ± 3.56）年，两组工龄比较，差异无统计学意义（t = - 0.939，P > 0.05）。对三组对象的唾液进行采集，作为本次研究的样品。
1.1.2 仪器与试剂
AAnalyst 800石墨炉原子吸收分光光度计（PerkinElmer公司），具有THGA原子化器系统、纵向塞曼效应校正装置和自动进样器；热解涂层石墨管（PerkinElmer公司）；锰空心阴极灯（PerkinElmer公司）；LDZ 4-0.8型离心机；LabTech EH 20B型电热板。锰标准溶液，编号GBW（E）080505，质量浓度1.000 g/L（上海市计量测试技术研究院）；硝酸，优级纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试验原理
样品经前处理后，在锰元素特定波长下，用石墨炉原子吸收光谱法测定锰含量[7]。
1.2.2 样品采集与前处理
1）唾液采集。工人漱口后，通过咀嚼棉签采集唾液样本约1.5 mL于离心管中，置于4 ℃冰箱中保存备检。2）前处理。将唾液取出恢复至室温，于离心机上2 000 r/min离心10 min（离心半径8.5 cm），吸取0.5 mL上清液于小烧杯中，加入2 mL硝酸，过夜。然后于电热板上120 ℃消解至近干，用体积分数0.2%的硝酸溶液定容至2 mL，摇匀，转移至石墨炉样品杯中，上机待测。同时以纯水经相同前处理过程后的硝酸溶液做样品空白。
1.2.3 仪器工作条件
灯电流：10 mA；波长：279.5 nm；狭缝：0.2 nm；进样量：20 μL。石墨炉升温程序见表 1。
表 1 石墨炉升温程序步骤 温度/C 坡升时间/s 保留时间/s 氩气流量/(mL/min) 1 110 1 30 250 2 130 15 30 250 3 1 100 10 20 250 4 1 900 0 3 0 5 2 450 1 3 250 1.2.4 分析步骤
1）标准曲线绘制。将锰标准溶液逐级稀释成20.00 μg/L的标准使用液（测定用标准母液），以体积分数1%的HNO3为标准空白，按设定浓度由仪器自动稀释成5、10、15、20 μg/L的标准系列，在上述条件下测定，仪器自动绘制标准曲线。2）样品测定。将消解好的样品转移至样品测定杯，按编号依次放置于样品盘中，样品的测定条件与标准曲线相同。
1.2.5 结果计算
按公式C = 4（c - c0）计算结果，式中：C为唾液样品中锰的质量浓度（μg/L）；c为样品测定质量浓度（μg/L）；c0为样品空白测定质量浓度（μg/L）。
1.2.6 统计学分析
采用EpiInfo 7.0进行数据录入，用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本的t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 石墨炉工作条件
2.1.1 灰化温度的选择
随机选取一名对照组工人的唾液，经前处理后转移至石墨炉样品杯中。固定原子化温度2 000 ℃，每次提高100 ℃灰化温度进行试验，结果见图 1。
2.1.2 原子化温度的选择
随机选取一名对照组工人的唾液，同样方法前处理后，固定灰化温度1 100 ℃，每次提高100 ℃原子化温度进行试验，结果见图 2。
2.2 方法线性及检出限
在锰质量浓度为0 ~ 20 μg/L的范围内，一次线性回归方程为Y = 0.015 87 x + 0.004 80，相关系数为0.999 2（P < 0.01）（Y为吸光度；x为锰质量浓度，单位μg/L）。特征浓度为5.4 pg/0.004 4 Abs。按DL = 3 Sb/s计算方法的检出限[Sb为11次（参照原子吸收光度计检定规程中检出限的计算）空白测量结果的标准差，s为标准曲线的斜率]，DL = 3 × 0.001 56/0.015 87，计算的检出限为0.29 μg/L。进样量为20 μL时，检出限为5.8 pg。
2.3 方法准确度
随机选取18份对照组工人唾液样品，并随机平分为三组（作为本底），离心机上2 000 r/min离心10 min（离心半径8.5 cm），吸取0.5 mL上清液于小烧杯中，三组分别加入20 μg/L的锰标准液0.5、1.0、1.5 mL，加入2 mL硝酸，过夜。然后于电热板上120 ℃消解至近干，用体积分数0.2%的硝酸溶液定容至2 mL，摇匀，转移至石墨炉样品杯中，做加标回收试验, 结果显示高中低三组加标浓度回收率在85% ~ 106%之间。见表 2。
表 2 加标回收率测定结果样品编号 本底值/ (μg/L) 加标值/ (μg/L) 加标测定值/ (μg/L) 回收率/% 1 6.8 5 11.2 88 2 7.8 5 12.7 98 3 8.1 5 12.6 90 4 8.4 5 13.1 94 5 5.5 5 10.3 96 6 2.2 5 7.3 102 7 5.6 10 14.6 90 8 4.7 10 13.2 85 9 9.8 10 18.7 89 10 6.6 10 15.6 90 11 7.6 10 17.1 95 12 8.9 10 17.8 89 13 5.2 15 19.5 95 14 5.3 15 19.2 93 15 4.7 15 19.6 99 16 4.2 15 17.4 88 17 10.2 15 26.1 106 18 5.6 15 19.5 93 2.4 方法精密度
随机选取三份对照组工人唾液样品，按2.3方法制备高、中、低浓度3个样品，分别测定6次，计算相对标准偏差，结果显示相对标准偏差为1.5% ~ 1.8%。见表 3。
表 3 三种样品精密度测定结果样品编号 测定值/(μg/L) 均值/(μg/L) RSD/% (低浓度组） 8.3 ~ 8.7 8.5 1.8 2(中浓度组） 17.3 ~ 18.1 17.6 1.5 3(高浓度组) 21.4 ~ 22.3 21.9 1.7 2.5 样品测定结果分析
113名低接触组工人唾液锰质量浓度范围为0.4 ~ 35.2 μg/L，均值（7.68 ± 6.98）μg/L；121名高接触组工人唾液锰质量浓度最低0.4 μg/L、最高76.0 μg/L，均值为（13.38 ± 15.36）μg/L。资料经方差齐性检验和正态性检验后呈正态分布且方差齐。两组均值比较，差异有统计学意义（t = - 5.70，P < 0.01）。
135名对照组唾液锰质量浓度最低0.4 μg/L、最高35.2 μg/L，均值为（7.65 ± 5.57）μg/L，234名接触组工人唾液锰质量浓度均值（10.63 ± 12.37）μg/L。资料经方差齐性检验和正态性检验后呈正态分布且方差齐。两组均值比较，差异有统计学意义（t = - 4.748，P < 0.01）。
3. 讨论
唾液样品前处理时，要特别注意器皿的清洁度，并且要选用优级纯硝酸，以降低本底值。在吸取离心后的上清液时要尤其注意不能吸入下面的沉淀，否则会使结果有较大的误差。样品加酸过夜后在电热板上消解，能得到较好的回收率（85% ~ 106%）。
本次试验显示，在锰质量浓度为0 ~ 20 μg/L范围内，该方法具有良好的线性。但超出此浓度范围曲线会有弯曲，因此如果遇高浓度样品，应稀释后测定。
原子吸收测定时灰化温度和原子化温度的选择是关键。为去除样品基体干扰，减少背景吸收，保证分析的重现性，应在分析元素不受损失的前提下采取比较高的灰化温度；在吸光度及峰形均满意的前提下，选择比较低的原子化温度。灰化温度在300 ℃时峰形拖尾比较严重，随着温度升高，峰形逐渐对称，在1 100 ℃时，峰形对称，且出峰时间较合适。原子化温度低时峰形比较矮胖，随着温度升高，在1 900 ℃时峰形较好，吸光度达到平台。综合考虑吸光度、峰形、峰高、出峰时间及石墨管寿命，选择灰化温度1 100 ℃为最佳灰化温度，原子化温度1 900 ℃为最佳原子化温度。为选择最佳的灰化和原子化温度，应做灰化温度图（见图 1）和原子化温度图（见图 2）。
试验使用热解涂层石墨管，致密性好、耐高温、记忆效应小，能很好地降低背景吸收，采用比较先进的仪器（THGA原子化器系统、纵向塞曼效应校正装置和自动进样器），不但操作简便，更使测定结果有较好的准确度和精密度。
从样品测定结果的统计分析来看，接触组工人唾液锰水平显著高于对照组，其中接触组中的高接触组工人唾液锰含量又显著高于低接触组，差异均有统计学意义（P < 0.01）, 提示唾液锰可能是锰接触工人接触水平较好的生物标志物。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
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图 2 各组大鼠肺组织Masson染色（200 ×）
注：A：阴性对照组；B：SiO2模型组；C：吡非尼酮阳性对照组；D：橙皮素低剂量组；E：橙皮素中剂量组；F：橙皮素高剂量组。
表 1 各组大鼠体重变化情况比较
（n = 9，g） 组别 第1天 第7天 第14天 第21天 第28天 阴性对照组 196.67 ± 6.02 238.56 ± 8.97 296.22 ± 8.84 344.89 ± 9.92 385.22 ± 11.29 SiO2模型组 196.00 ± 4.15 229.56 ± 10.80 284.44 ± 15.47 327.33 ± 18.80 356.44 ± 17.10 a 吡非尼酮阳性对照组 195.44 ± 4.92 233.56 ± 8.41 288.78 ± 14.87 336.89 ± 16.58 372.11 ± 15.79 b 橙皮素低剂量组 196.67 ± 5.68 232.22 ± 9.83 289.89 ± 11.60 334.11 ± 15.74 366.89 ± 18.27 a 橙皮素中剂量组 195.89 ± 4.40 235.89 ± 8.16 291.67 ± 11.47 337.11 ± 11.93 371.22 ± 12.17 a，b 橙皮素高剂量组 195.33 ± 4.97 235.56 ± 5.00 292.67 ± 9.67 339.44 ± 13.91 374.00 ± 12.22 b F值 0.12 1.17 0.95 1.39 3.67 P值 0.99 0.34 0.46 0.24 < 0.01 < 0.01 注：a与阴性对照组相比，P < 0.05；b 与SiO2模型组比较，P < 0.05。 
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表 2 各组大鼠肺湿重和肺系数比较
（n = 6） 组别 肺湿重/g 肺系数/% 阴性对照组 1.41 ± 0.09 0.37 ± 0.02 SiO2模型组 3.79 ± 0.30 a 1.04 ± 0.07 a 吡非尼酮阳性对照组 3.25 ± 0.50 a，b 0.86 ± 0.10 a，b 橙皮素低剂量组 3.37 ± 0.31 a 0.90 ± 0.09 a，b 橙皮素中剂量组 3.16 ± 0.40 a，b 0.86 ± 0.09 a，b 橙皮素高剂量组 3.13 ± 0.64 a，b 0.83 ± 0.15 a，b F值 23.68 34.30 P值 < 0.01 < 0.01 注: a与阴性对照组相比，P < 0.05；b与SiO2模型组比较，P < 0.05。
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表 3 各组大鼠肺泡炎和肺纤维化评分比较
（n = 3） 组别 肺泡炎 肺纤维化 阴性对照组 0 0 SiO2模型组 2.27 ± 0.31 a 2.40 ± 0.26 a 吡非尼酮阳性对照组 1.60 ± 0.17 a，b 1.57 ± 0.21 a，b 橙皮素低剂量组 1.80 ± 0.10 a，b 1.93 ± 0.31 a，b 橙皮素中剂量组 1.53 ± 0.15 a，b 1.63 ± 0.21 a，b 橙皮素高剂量组 1.33 ± 0.25 a，b，c 1.40 ± 0.30 a，b F值 47.95 34.72 P值 < 0.01 < 0.01 注：a与阴性对照组相比，P < 0.05；b与SiO2模型组比较，P < 0.05；c与橙皮素低剂量组比较，P < 0.05。
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表 4 各组大鼠肺组织的MDA含量比较
（n = 6，nmol/mg pro） 组别 MDA 阴性对照组 9.36 ± 1.24 SiO2模型组 13.13 ± 1.97 a 吡非尼酮阳性对照组 9.61 ± 1.56 b 橙皮素低剂量组 9.45 ± 1.66 b 橙皮素中剂量组 9.57 ± 1.6 b 橙皮素高剂量组 8.61 ± 0.83 b F值 6.64 P值 < 0.01 注： a 与阴性对照组相比，P < 0.05； b 与 SiO2 模型组比较， P < 0.05。
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表 5 各组大鼠肺组织的CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC活力比较
（n = 6，U/mg pro） 组别 CAT SOD GSH-Px T-AOC 阴性对照组 10.97 ± 2.74 49.45 ± 3.01 82.16 ± 8.38 7.75 ± 1.36 SiO2模型组 9.44 ± 1.59 61.27 ± 3.82 a 71.58 ± 13.16 8.69 ± 1.37 吡非尼酮阳性对照组 15.59 ± 4.61 a，b 67.45 ± 7.46 a 92.42 ± 14.93 b 9.69 ± 0.95 橙皮素低剂量组 20.33 ± 1.96 a，b 70.65 ± 5.51 a，b 85.51 ± 14.03 9.76 ± 1.33 橙皮素中剂量组 24.24 ± 5.42 a，b 74.55 ± 7.71 a，b 92.96 ± 13.26 b 10.87 ± 2.72 a，b 橙皮素高剂量组 30.72 ± 3.85 a，b，c 76.24 ± 7.43 a，b 100.5 ± 15.25 a，b 12.38 ± 2.39 a，b F值 30.16 13.77 3.42 4.87 P值 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 注: a与阴性对照组相比，P＜0.05；b与SiO2模型组比较，P＜0.05；c与橙皮素低剂量组比较，P < 0.05。
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