劳动者在职业活动过程中接触含有三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）的有机溶剂后，少数接触者会出现以发热、皮疹、肝功能损害为主要临床表现的职业病，即职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational medicamentosa -like dermatitis due to trichloroethylene，OMLDT）。自1988年广东省发现首例由TCE所致的严重剥脱性皮炎患者至今，已经发现500余例由TCE引起的严重皮肤损害病例^[1-3]。OMLDT的发病机制一直是近年来研究的重点，目前大部分学者认为该疾病属于Ⅳ型变态反应，但有关TCE免疫性损伤的调节机制研究还刚起步。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Tregs）是近些年来免疫学研究中的一个热点，研究表明CD4⁺CD25⁺Treg细胞对调节机体免疫反应、维持机体免疫稳态至关重要。本研究对28例OMLDT患者外周血CD4⁺CD25 ⁺Tregs比例进行了检测及动态观察，拟通过对患者细胞免疫功能状态的研究，为该病的免疫学发病机制提供线索。

1.   对象与方法

1.1   对象

选择2016年6月—2019年6月深圳市职业病防治院按《职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准》（GBZ 185—2006）^[4]诊断为“职业性三氯乙烯药疹样皮炎”的住院患者作为实验组，共28例，其中多形红斑14例，重症多形红斑14例。既往均体健，发病前无肝毒性药物使用史。同时选取年龄、性别相匹配的健康体检者作为对照组，共28例。两组人员纳入标准：均无影响造血和免疫功能的基础疾患、首次就诊3个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、无癌症史、放疗及化疗史、无其他骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。所有参与者均签订知情同意书。本课题通过本院伦理委员会审查批准。

1.2   方法

1.2.1   血样采集

28名患者均在入院1 d内（急性期，距发病后1~ 30 d，平均12.39 d）于清晨空腹状态下取以上对象的外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝处理。患者入院后均以早期足量使用糖皮质激素为主要治疗措施的综合免疫抑制治疗，初始剂量为静脉注射甲泼尼松300 ~ 1 000 mg/d，根据体温、皮疹、肝功能等变化逐渐减量至停用，甲泼尼松总用量为（888 143 ± 4 300）mg。经治疗，患者皮疹消退，各脏器指标均恢复正常，并于停用激素及影响免疫功能的药物后定为临床治愈期，距发病48 ~ 330 d，平均108.39 d；停用激素均在1周内，停用后与上法相同采集血样送检。对照组血样采集同上。

1.2.2   外周血淋巴细胞亚群及CD4⁺CD25⁺Tregs比例检测方法

应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群及CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例。取外周血100滋L，置于流式检测管中，分别加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的鼠抗人CD4抗体12滋L和巯基化藻红蛋白（phycocrithrin，PE）标记的鼠抗人CD25抗体12滋L，CD8-cy5-PE抗体12滋L。另设加入FITC标记的鼠抗人CD4抗体12滋L和PE标记的鼠抗人同型阴性Y1对照抗体12滋L的对照管。充分混匀各管，4 ℃暗室孵育30 min后，每管各加本实验室配制的溶血素3 000滋L，充分打匀后置室温孵育12 min，1 000 r/min（离心半径为10 cm）离心5 min，弃上清加鞘液500滋L，用BD FAC2Scabilur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）检测，Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异对照值。以CD4⁺CD25⁺Tregs占外周血CD4⁺T细胞的比例来评价CD4⁺CD25⁺Tregs的表达水平。

1.2.3   患者肝功能指标检测

人血白蛋白（ALB）、直接胆红素（DBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）由Beckman DXC800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）完成检测^[5]。

1.2.4   统计学分析

应用SPSS 18.0软件包进行统计学分析，所有统计结果以均数±标准差（x ± s）表示。急性期组、临床治愈组、健康对照组各指标总体比较使用方差分析，急性期组和临床治愈组各指标分别与健康对照组两两比较采用LSD检验，急性期组与临床治愈组各指标比较采用配对t检验。实验组不同临床类型指标比较采用独立样本t检验。实验组急性期CD4⁺CD25⁺Tregs比例与肝功能指标的相关性分析使用Pearson相关性检验。所有检验均为双侧，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   各组检测结果比较

OMLDT急性期组、临床治愈组与健康对照组之间外周血CD4⁺CD25⁺Tregs比例不同，差异有统计学意义（P < 0.01）。OMLDT急性期组和临床治愈组CD4⁺CD25⁺Tregs比例均低于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），OMLDT急性期组CD4⁺CD25⁺Tregs比例低于临床治愈组，差异有统计学意义（P < 0.01）。

OMLDT急性期组、临床治愈组与健康对照组之间外周血CD4⁺T细胞比例、CD8⁺TT细胞比例及CD4⁺T/ CD8⁺T不同，差异有统计学意义（P < 0.01）。OMLDT急性期组CD4⁺TT细胞比例低于健康对照组及临床治愈组，差异有统计学意义（P < 0.01）。OMLDT急性期组CD8⁺TT细胞比例高于健康对照组和临床治愈组，差异有统计学意义（P＜0.01）。临床治愈组的CD4⁺TT细胞与健康对照组相比差异无统计学意义（P = 0.264）；临床治愈组的CD8⁺T T细胞与健康对照组相比，差异无统计学意义（P = 0.602）。见表 1。

表  1  CD4⁺CD25⁺Tregs及T细胞亚群的检测结果

分组	例数	CD4+CD25+Tregs /%	CD4+ T细胞/%	CD8+T细胞/%	CD4+/CD8+
健康对照组	28	4.77 ± 0.81	42.96 ± 2.48	28.38 ± 4.92	1.66 ± 0.59
临床治愈组	28	2.40 ± 0.42 a	43.29 ± 2.67	28.61 ± 5.1	1.56 ± 0.34
急性期组	28	0.97 ± 0.52 a b	30.57 ± 8.63 a b	42.68 ± 13.07 a b	0.84 ± 0.42 a b
F值		277.84	50.17	25.48	26.89
P值		< 0.01	< 0.01	< 0.01	< 0.01
注：a与健康对照组比较，P < 0.01；b与临床治愈组比较，P < 0.01。

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2.2   不同临床类型OMLDT结果比较

急性期及临床治愈期OMLDT患者不同临床类型外周血CD4⁺CD25⁺Treg细胞及T细胞亚群比较，差异均无统计学（P > 0.05）。见表 2。

表  2  按疾病分类CD4⁺CD25⁺Tregs及T细胞亚群比较

	分组	例数	CD4+CD25+Tregs/%	CD4+ T细胞/%	CD8+T细胞/%	CD4+/CD8+
急性期	多形红斑	14	0.88 ± 0.46	29.00 ± 6.92	42.29 ± 12.92	0.81 ± 0.41
	重症多形红斑	14	1.06 ± 0.58	32.12 ± 10.08	43.07 ± 13.69	0.87 ± 0.44
	t值		0.780	0.924	0.024	0.129
	P值		0.385	0.345	0.877	0.722
临床治愈期	多形红斑	14	2.35 ± 0.34	43.21 ± 2.69	27.64 ± 5.27	1.61 ± 0.33
	重症多形红斑	14	2.46 ± 0.49	43.36 ± 2.76	29.57 ± 5.01	1.51 ± 0.28
	t值		0.465	0.019	0.983	0.802
	P值		0.501	0.891	0.331	0.379

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2.3   OMLDT急性期组CD4⁺CD25⁺Tregs的相关性分析

OMLDT急性期组CD4⁺CD25⁺Tregs的表达与患者年龄呈弱的线性相关（r = 0.377，P = 0.048）；与其他临床资料如患者的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、人血白蛋白（ALB）、血清总胆红素（TBI）、外周血T细胞亚群CD4⁺TT细胞、CD8⁺T T细胞及CD4⁺T/CD8⁺T比值均无线性相关性（P > 0.05）。见表 3。

表  3  急性期 CD4⁺CD25⁺Tregs 与 OMLDT 患者的入院时临床参数的关系

临床参数	最小值	最大值	均值 ± 标准差	相关系数r	P值
年龄/岁	16	49	25.36 ± 8.74	0.377	0.048
ALT/（U/L）	51	2 307	686.43 ± 705.81	0.282	0.164
AST/（U/L）	27	1 719	343.75 ± 420.03	0.210	0.283
ALB/（g/L）	23	44	33.55 ± 5..42	- 0.176	0.370
TBI/（μmol/L）	9.8	399	71.60 ± 86.79	0.001	0.995
CD4+T细胞/%	13.0	51.0	30.57 ± 8.63	- 0.037	0.853
CD8+ T细胞/%	18.0	68.0	42.68 ± 13.07	- 0.113	0.567
CD4+/CD8+	0.19	1.8	0.84 ± 0.42	0.099	0.616

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3.   讨论

三氯乙烯药疹样皮炎患者临床表现主要为皮疹及肝损伤，而目前多数学者认为机体的这些损伤与迟发型变态反应（IV型变态反应）有关。OMLDT中炎症性反应的发生机制方面，多数学者进行了大量研究，但有关TCE免疫性损伤的调节机制研究还刚起步。CD4⁺CD25⁺Tregs是T细胞中的一类重要亚群，占正常人或小鼠外周血及脾CD4⁺T细胞的5% ~ 10% ^[6]。Tregs可通过与靶细胞直接接触，通过细胞表面的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和膜型TGF-β的作用，下调靶细胞表面的IL-2Ra链的表达，抑制靶细胞的增殖；还可以通过分泌TGF-β和IL-10等细胞因子间接抑制T细胞活化、增殖从而发挥免疫负调控功能。Tregs不仅可以抑制性调节CD4⁺TT、CD8⁺TT淋巴细胞及B淋巴细胞的活化和增殖，而且参与调节天然免疫系统，通过给发挥效应的免疫应答设置一个障碍维持机体免疫系统的平衡状态^[7]。近年来，国内外研究发现Tregs数目减少或功能降低导致体内免疫稳态破坏在自身免疫性疾病的发生发展中起至关重要的作用^[8]。

对于CD4⁺CD25⁺Tregs在三氯乙烯药疹样皮炎发病机制中发挥了何种作用，目前研究不多。在致敏的动物模型中，BALB/c小鼠脾脏组织中CD4⁺CD25⁺ Tregs所占CD4⁺T细胞的百分比，总体上呈现“先升高后下降”的趋势，提示Tregs可能在TCE致敏过程中发挥了重要的作用^[9]。

本研究显示28例OMLDT患者急性期组的外周血中CD4⁺CD25⁺Tregs比例低于健康对照组（P < 0.01），而且即使患者达到临床治愈期，患者的外周血中CD4⁺CD25⁺Tregs比例还是低于健康对照组（P < 0.01）。OMLDT患者急性期即表现为外周血CD4⁺ CD25⁺Tregs比例的显著降低，与动物实验结果“先升高后降低”的现象^[9]不一致。这种不同可能与OMLDT患者三氯乙烯的接触时间有关，患者一般在接触4周后发病。这种发病时CD4⁺CD25⁺Tregs明显减少的现象，与某些自身免疫性疾病如类风湿关节炎^[10]、系统性红斑狼疮的外周血CD4⁺CD25⁺Tregs减少相似^[11]。OMLDT患者急性期外周血CD4⁺CD25⁺Tregs减少表明三氯乙烯对机体作用抑制了CD4⁺CD25⁺Tregs的增殖，导致其数量减少，Tregs减少对单核细胞或巨噬细胞免疫抑制作用减弱，引起炎性反应状态，使机体对三氯乙烯激活的T细胞活化抑制作用减弱，因此，造成患者出现类似自身免疫反应的组织细胞损害。

同时，急性期患者的CD4⁺TT细胞比例低于健康对照组（P < 0.01），而CD8⁺TT细胞比例高于健康对照组（P < 0.01），且CD4⁺/CD8 ⁺也低于健康对照组（P < 0.01），这一结果与张艳芳等报道结果相一致^[12]。

结果显示，两种皮炎类型OMLDT患者（多形红斑及重症多形红斑）在CD4⁺CD25⁺Tregs、T细胞亚群方面数据差异均无统计学意义（P > 0.05），这可能与本研究中没有剥脱性皮炎及大疱表皮坏死这两种类型患者有关，说明多形红斑及重症多形红斑二者病情严重程度尽管不同，但其发病时CD4⁺CD25⁺Tregs的改变大致相近。

OMLDT患者外周血CD4⁺CD25⁺Tregs比例除与年龄弱相关外，与CD4⁺TT及CD8⁺TT及其他肝功能指标无明显相关。通过大剂量糖皮质激素为基础的综合治疗，所有28例患者均达到临床痊愈。通过治疗，CD4⁺T CD25⁺Tregs的比例达到治愈期时较急性期明显增加（P < 0.01），但是即使患者在临床治愈期的外周血T细胞亚群恢复正常水平，其调节性T细胞也仍然低于健康对照者（P < 0.01），这一现象表明，OMLDT患者的CD4⁺CD25⁺Tregs的恢复缓慢，这可能是部分患者并发银屑病这样的自身免疫性疾病的机制之一^[13]。

总之，本次研究表明，OMLDT患者急性期CD4⁺T CD25⁺Tregs比例明显减少，这可能是导致OMLDT患者表现出明显的全身炎性反应综合征的免疫机制之一。本研究为将来开展以间充质干细胞输注以提高OMLDT患者的体内的调节性T细胞比例，以抑制过度的自身免疫损害，提供理论依据；同时，也可作为将来在临床上减少糖皮质激素长期应用带来的各种并发症提供理论依据。