百草枯（化学名称是1，1’-二甲基-4，4’-联吡啶阳离子盐）和敌草快（1，1’-亚乙基-2，2’-联吡啶阳离子盐）均为联吡啶类季铵盐，属于高效、低廉的灭生性除草剂，曾被全球推广使用。百草枯的毒性极大，会造成心肺和肝肾等严重损害，且无特效解毒药，口服中毒病死率高。我国自2016年7月1日停止百草枯水剂在国内的销售和使用，但是仍有许多不法店铺和企业在生产和售卖“百草枯”，社会上仍频繁出现百草枯中毒事件。敌草快作为百草枯的替代品大量出现在市场上，其除草效果不亚于百草枯，但对人体的伤害也非常大，与百草枯中毒一样，无特效解毒药。因此建立简单有效的百草枯和敌草快的检测方法，对中毒应急、公共安全和临床医学早期诊断及治疗具有重要意义。

百草枯和敌草快均易溶于水，不易溶于有机溶剂，在酸性和中性溶液中稳定，具有强离子特性，目前检测方法有电化学法、光谱法、色谱法和质谱法，其中液质联用法使用较为广泛^[1-5]，均须单独选配亲水性色谱柱（HILIC），配合高浓度缓冲盐作为流动相，但高盐易造成系统堵塞；百草枯和敌草快是强极性化合物，极易在液相色谱柱上吸附而不易洗脱^[2]，导致样品间相互干扰，定性、定量存在不稳定；且液质联用仪的价格成本、人力成本、使用维护成本都较高。

国内也有文献^[6-11]报道采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测百草枯，其中不经过衍生直接测定的方法，前处理需采用分离柱或水浸法，操作技术要求高、过程烦琐；经过衍生后测定的方法，衍生产物均为八氢化合物，仍有两个双键未反应^[8-11]，反应不完全，仪器响应偏低，方法检出限0.05 ~ 0.15 μg/mL，定量限0.1 ~ 1 μg/mL，灵敏度不高。本研究通过优化衍生条件，提高了检测灵敏度，现报告如下。

1.   材料与方法

1.1   仪器与试剂

1.1.1   仪器

7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；H2050R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MS3漩涡混合器（德国IKA公司）；SB2200-T超声波清洗仪（上海必能倍超声有限公司）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；AE-200电子天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.1.2   试剂

百草枯二氯化物（纯度99.2%），购自北京北方伟业计量技术研究院；敌草快二溴盐（100 μg/mL），购自农业部环境保护科研监测所；乙基百草枯（纯度98%），购自Toronto Research Chemicals公司；硼氢化钠（分析纯），购自成都艾科达化学试剂有限公司；氯化镍（分析纯），购自成都艾科达化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯），购自西陇化工股份有限公司；高氯酸（分析纯），购自天津市鑫源化工有限公司；无水乙醇（分析纯），购自天津市福晨化学试剂厂；乙酸乙酯（色谱纯），购自西陇科学股份有限公司。

1.2   方法

1.2.1   溶液配制

（1）百草枯标准溶液：准确称量百草枯二氯化物标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的百草枯阳离子储备液，取1.0 mL该标准溶液，用甲醇稀释成100 μg/mL百草枯阳离子标准溶液。

（2）混合标准储备液：分别准确量取适量的百草枯、敌草快标准溶液，用甲醇定容，配制成10 μg/mL的百草枯阳离子、敌草快阳离子混合标准溶液，于4 ℃冰箱保存，根据需要用甲醇稀释成所需浓度的混合标准应用液。

（3）内标储备液：准确称量乙基百草枯，用甲醇配制成1.0 mg/mL的乙基百草枯阳离子内标储备液，取1.0 ml该标准溶液，用甲醇稀释成100 μg/mL乙基百草枯阳离子标准溶液，于-4 ℃冰箱保存，根据需要用甲醇稀释成所需浓度的内标应用液。

（4）0.3 g/mL硼氢化钠溶液：称取15.0 g硼氢化钠于50 mL 5 mol/L氢氧化钠溶液中，摇匀备用。

（5）0.01 g/mL氯化镍溶液：称取1.0 g氯化镍于100 mL纯水中，摇匀备用。

（6）含10%（体积分数，下同）高氯酸的乙醇溶液：量取1.0 mL高氯酸加入9.0 mL乙醇中，摇匀备用。

1.2.2   气相色谱条件

色谱柱：DB-5MS 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；柱温：80 ℃保持1 min，以15 ℃/min程序升温升至280 ℃，保持5 min；进样口温度：280 ℃；柱流速：1 mL/min；进样方式：不分流进样。

1.2.3   质谱条件

EI源；离子源温度：230 ℃；扫描方式：（1）全扫描（SCAN），质量范围:40 ~ 450 amu；（2）选择离子监测（selective ion monitored，SIM），百草枯衍生物m/z 196、181、96，敌草快衍生物m/z 194、111、83，乙基百草枯衍生物m/z 224、209、110。

1.2.4   尿液样品前处理

取1.0 mL尿液于25 mL玻璃烧杯内，加入2 μg内标，1.0 mL的含10%高氯酸的乙醇溶液，待衍生化。

1.2.5   全血样品前处理

取1.0 mL全血（肝素钠抗凝）于15 mL具塞塑料离心管内，加入2 μg内标，3.0 mL纯水，1.0 mL的含10%高氯酸的乙醇溶液，旋涡震荡3 min、超声2 min，高速离心（离心半径9.5 cm，8 000 r/min，2 min），取全部上清液于25 mL玻璃烧杯内，待衍生化

1.2.6   衍生化

向经过前处理的样品中加入1.0 mL的0.01 g/mL氯化镍，缓慢加入0.3 mL的0.3 g/mL硼氢化钠溶液，在60 ℃反应40 min，取出冷却至室温，将反应液转移至15 mL具塞塑料离心管内，加入1.0 mL乙酸乙酯，旋涡震荡3 min，高速离心（离心半径9.5 cm，8 000 r/min，2 min），上清液供GC-MS测定。

2.   结果与讨论

2.1   百草枯、敌草快和乙基百草枯的衍生物色谱图

百草枯、敌草快和乙基百草枯经过硼氢化钠和氯化镍的还原，化合物的6个双键全部氢化，生成对应极性低的联哌啶，其相对分子质量分别为196、194、224，较其他文献^[8-11]的还原产物八氢化合物反应更完全。本研究选择监控衍生物的质谱碎片离子分别是：百草枯衍生物：m/z 196、181、96，敌草快衍生物m/z 194、111、83，乙基百草枯衍生物m/z 224、209、110；将3个衍生物的离子峰m/z 181、194、224分别作为衍生物的定量离子。由图 1看到敌草快的还原产物m/z 194有两个峰（标注2、3），质谱图相同，敌草快衍生产物存在顺反同分异构体，反式结构先出峰，与高利娜等^[12]报道一致。本研究观察了在不同实验条件、不同添加浓度的尿液、血液样品均存在反、顺两种构型。经统计，反式与顺式的比率为3.2:1，相对标准偏差为5.3%（n = 20）。衍生产物的总离子流色谱图见图 1。

图  1  衍生产物的总离子流色谱图

注：1为百草枯的衍生产物；2、3为敌草快的衍生产物；4为乙基百草枯的衍生产物

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   方法优化

2.2.1   衍生试剂

为了使反应快速、完全，本研究选择过量的硼氢化钠（每次反应加入90 mg）。硼氢化钠选择用碱性溶液，既能保证反应在碱性条件下进行，又能减少水解损失、方便操作。通过试验，衍生试剂用量达到反应时间短、反应充分（百草枯的双键全部参与反应）的要求。

2.2.2   沉淀蛋白的试剂和用量

本研究考察了尿液样品在“原瓶直接衍生”与“沉淀蛋白后取上清液衍生”的对比，二者的反应过程（反应泡沫、剧烈程度）、衍生产物响应几乎一样，因为沉淀蛋白的步骤多了震荡、离心、转移等操作，所以本方法选择尿液样品在原瓶直接进行衍生反应。

全血样品直接衍生，反应时间长、产生的泡沫多、基质干扰非常大，需要将血液样品沉淀蛋白后取澄清的上清液进行反应。在1.0 mL血液（含有1.0 μg混合标准）中分别加入10%三氯乙酸水液（体积分数）、10%高氯酸水溶液（体积分数）、含10%高氯酸的乙醇溶液（体积分数）、乙腈（色谱纯）的反应效果。结果显示含10%高氯酸的乙醇溶液沉淀蛋白后衍生的效果最优。见表 1。

表  1  不同沉淀蛋白试剂对衍生反应的影响

沉淀蛋白试剂	百草枯衍生物峰面积	敌草快（反式）衍生物峰面积
10%三氯乙酸水液	0	0
10%高氯酸水液	1 769	4 676
含10%高氯酸的乙醇溶液	1 801	4 904
乙腈（色谱纯）	114	570

下载: 导出CSV 

| 显示表格

本研究考察了全血样品的稀释体积影响，在1 mL血液（含有0.5 μg混合标准）中分别加入纯水0、0.5、1.0、3.0、4.0 mL，再进行沉淀蛋白，结果显示加入3.0 mL水时沉淀蛋白效果最优，产生泡沫少。

本研究考察了1 mL血液和尿液（分别含有0.5 μg混合标准）中高氯酸含量（体积分数，下同）分别为0、5%、10%、20%、30%的反应效果，结果显示含10%高氯酸的乙醇溶液沉淀蛋白后衍生效果最优。见表 2。

表  2  不同高氯酸含量对衍生反应的影响

高氯酸体积分数/%	血液中衍生物峰面积			尿液中衍生物峰面积
	百草枯	敌草快（反式）		百草枯	敌草快（反式）
0	44	133		696	2 071
5	495	1 291		1 929	4 390
10	1 004	2 313		2 349	4 399
20	653	1 795		100	663
30	0	0		0	0

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2.3   反应温度和时间

在其他条件相同的情况下，本研究考察了不同反应温度（25、40、60、80、100 ℃）对衍生反应的影响，结果显示60 ℃时还原反应产物峰面积最高。考察了在不同反应时间（10、20、30、40、60、80、100 min）对衍生反应的影响，结果显示40 min时峰面积最高。因此本研究最终选择60 ℃、40 min作为反应条件。

2.3   标准曲线和检出限

取1 mL空白血样和尿样，分别加入一定量的混合标准应用液（使样品中标准的质量浓度为：0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL）和内标应用液（样品中内标质量浓度2 μg/mL），配制空白基质标准系列，经前处理后测定，内标法定量。以空白样品添加低浓度混合标准液，进行样品前处理后上机测定，以3倍信噪比（S/N）对应的样品浓度作为检出限，以10倍信噪比对应的样品浓度作为定量限，结果见表 3。

表  3  方法测定范围和检出限

药物	基质	测定范围/（μg/mL）	回归方程	相关系数r	检出限/（μg/mL）	定量限/（μg/mL）
百草枯	血液	0.05 ~ 2.0	y = 0.504 0 x - 0.004 9	0.999 5	0.008	0.025
	尿液	0.02 ~ 2.0	y = 0.810 4 x - 0.007 7	0.999 9	0.004	0.014
敌草快（反式）	血液	0.05 ~ 2.0	y = 1.128 8 x - 0.010 4	0.999 7	0.004	0.012
	尿液	0.02 ~ 2.0	y = 2.016 6 x - 0.013 9	0.999 7	0.006	0.020

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   加标回收率和精密度

分别向各1.0 mL空白血样和尿样中加入0.15 μg、0.5 μg和1.0 μg混合标准溶液，每个浓度取6个样品，经前处理后进行检测，计算得到样品加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表 4。

表  4  全血和尿液中百草枯、敌草快的回收率和精密度（n = 6）

药物	加标浓度/（μg/mL）	全血			尿液
		回收率/%	RSD /%		回收率/%	RSD /%
百草枯	0.15	113.8	6.6		113.1	6.0
	0.50	108.5	2.1		94.7	2.8
	1.00	115.0	5.0		94.1	1.1
敌草快 （反式）	0.15	100.0	5.8		98.3	2.6
	0.50	102.6	2.5		95.2	3.5
	1.00	101.0	4.1		96.4	2.4

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.5   样品稳定性试验

分别取多份正常人血液、尿液混匀后，每管取1.0 mL，各管加标量为0.5 μg/mL，混匀后置于4 ℃冰箱保存，于当天、第3天、第7天，经前处理后进行检测，结果显示4 ℃冰箱中全血、尿液至少可以保存7 d。结果见表 5。

表  5  样品稳定性试验

药物	测定时间	全血			尿液
		测定结果/（μg/mL）	下降率/%		测定结果/（μg/mL）	下降率/%
百草枯	当天	0.517			0.486
	第3天	0.494	4.6		0.458	5.7
	第7天	0.481	7.0		0.442	9.1
敌草快 （反式）	当天	0.506			0.488
	第3天	0.466	8.0		0.468	4.0
	第7天	0.462	8.8		0.453	7.2

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.6   干扰试验

血液、尿液样品基质比较复杂，本方法干扰试验主要考察生物样品的基体干扰。选用无百草枯、敌草快接触者的新鲜全血、尿液样品作为空白血液、尿液样品。空白血液样品衍生化后全扫描总离子流色谱图的色谱峰较多不易分辨（见图 2），部分空白血液样品在百草枯出峰时间8.4 min附近也有离子m/z 196的色谱峰，容易对低浓度样品造成干扰。因此本文选择离子m/z 181、194、224作为百草枯、敌草快、乙基百草枯衍生物的定量离子进行试验，试验结果血液、尿液样品无干扰。空白血样添加0.5 μg混合标准后色谱图见图 3。

图  2  空白血的总离子流色谱图

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  3  空白血添加0.5 μg混标的选择离子色谱图

注：1为百草枯，2、3为敌草快；4为内标

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.7   实际样品测定

采用本文建立的方法对广西壮族自治区职业病防治研究院收治的1名百草枯中毒患者的血液、尿液进行检测，在中毒患者的血液、尿液中均检出百草枯，血液中百草枯质量浓度为0.309 μg/mL，尿液中百草枯的含量为3.580 μg/mL，超出了本方法的定量上限。患者血液、尿液样品衍生反应后的选择离子色谱图见图 4、图 5。

图  4  患者血液的选择离子色谱图

注：1为百草枯，2为内标

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  患者尿液的选择离子色谱图

注：1为百草枯，2为内标

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   结论

本研究通过优化衍生条件（加入含体积分数为10%高氯酸的乙醇液等）使百草枯、敌草快、乙基百草枯衍生产物均为全氢化化合物，反应完全，检测过程无残留干扰，仪器响应好，方法检出限在0.004 ~ 0.008 μg/mL，定量限0.012 ~ 0.025 μg/mL。本方法采用小体积有机相液液提取，不需浓缩操作，前处理操作简便、1 h即可完成样品前处理。提取后直接测定，简便快捷，能够满足全血和尿液等生物样品中百草枯、敌草快的快速检测。气质联用法使用保留时间、离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据，定性结果准确。此外，本方法中硼氢化钠和氯化镍反应过于剧烈，有泡沫产生，需要转移至烧杯中才能避免反应泡沫溢出。衍生产物对仪器进样口洁净度要求较高，需及时更换进样衬管并截去色谱柱进样端一小段。

本方法简单准确、灵敏高，可适用于全血、尿液等生物样品中百草枯、敌草快的快速检测。