Follow-up study on mitochondrial DNA copy number in workers exposed to low concentration benzene in China
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+ English摘要:目的
探索低浓度苯接触工人线粒体DNA拷贝数的变化及其影响因素。
方法选择上海某化工厂150名低浓度苯接触工人作为2018、2019年连续两年的追踪研究对象，采用问卷调查收集研究对象一般情况，采用实时荧光定量PCR法检测外周血相对线粒体DNA拷贝数并作为氧化应激的检测指标，利用重复测量分析以及广义估计模型分析两年间苯接触工人线粒体DNA拷贝数情况的变化，并探讨其与作业环境中苯接触的关系。
结果研究对象在追踪期间的苯接触浓度中位数为0.46 mg/m3，第25百分位数为0.14 mg/m3，第75百分位数为0.49 mg/m3。2018年苯接触工人相对线粒体DNA拷贝数为5.79±0.84，2019年工人相对线粒体DNA拷贝数显著降低，为(4.66±0.58)，差异有统计学意义(P < 0.01)。重复测量方差分析结果显示：不同接触浓度工人相对线粒体DNA拷贝数差异有统计学意义(P < 0.05)；不同时间观察的线粒体DNA拷贝数不全相同，差异有统计学意义(P < 0.05)。广义估计模型分析结果显示：与高接触浓度组相比，中接触浓度组工人相对线粒体DNA拷贝数降低了0.25(P < 0.05)。未发现工龄、年龄、吸烟和饮酒对相对线粒体DNA拷贝数的影响。
结论在低于我国现行职业卫生标准的情况下，接触低浓度苯的作业工人仍可出现相对线粒体DNA拷贝数的改变，提示职业性苯接触可能导致线粒体损伤以及氧化应激的产生。
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苯是有机化学合成工业的重要原料和有机溶剂，广泛应用于合成树脂、农药、医药和制鞋等行业。职业接触苯所致的慢性健康损害中，以血液毒性为主要表现，可造成接触人群外周血白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞以及血小板减少。而苯所致危害中最严重的、最值得关注的是苯的遗传毒性，国际癌症研究中心(IARC)在1982年就将苯确定为Ⅰ类致癌物[1]。流行病学调查显示，苯接触可诱发人类再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病等疾病的发生[2-6]，但其致病机制目前并不明确，而苯代谢产物造成机体遗传物质的氧化应激损伤被认为可能是苯引起遗传损伤的通路之一[7-8]。
线粒体作为机体细胞内的重要细胞器，参与了能量产生、细胞凋亡、肿瘤的发生以及衰老等多种病理生理的代谢过程。与核基因组相比，线粒体DNA更容易受到致癌物及其代谢产物的攻击而损伤，会导致氧化应激的出现，产生突变、缺失等改变，同时已有研究提示，线粒体DNA的变化可能与某些癌症的产生相关[9-10]。
此外，虽然随着对苯健康损害的不断认识，世界各国都将苯的作业场所接触限值不断下调，但仍有研究报道，即使在低于1 ppm(3.48 mg/m3)的苯接触作业环境中工作，仍会出现血液系统的损害[2]。本研究拟通过对苯接触工人的追踪分析，探讨在我国现行职业卫生标准下，低浓度苯接触所致线粒体DNA拷贝数的动态变化及其可能的影响因素，为苯氧化应激与致癌机制的研究提供参考依据。
1. 对象与方法
1.1 对象
选择上海市某化工厂苯接触工龄≥1年的150名作业工人作为研究对象。调查对象为于2018年6月和2019年6月两次都接受外周血线粒体DNA拷贝数检测、连续接触苯(即一直从事苯接触工作，未调岗、离岗)且具备完整相关调查资料的工人，并排除患有血液系统疾病、肾功能衰竭、糖尿病、结核病等人员。研究对象接触的其他职业病危害因素使用量较少，且现场浓度非常低。
1.2 方法
1.2.1 问卷调查
于2018年6月和2019年6月分别对研究对象进行问卷调查，调查内容：一般情况包括姓名、年龄、文化程度等；职业史包括工作车间、工龄、作业时间、作业方式等；可能的影响因素包括吸烟、饮酒以及慢性病史、血液系统疾病家族史、药物史等情况。
吸烟指平均≥ 1支/d，饮酒指乙醇摄入平均≥ 10 g /d。由于本研究为低浓度苯接触下工人的线粒体DNA拷贝数分析，故选用了浓度的四分位数(第25、75百分位数)作为分组的节点。
1.2.2 样品采集与分析
经研究对象知情同意后，采集各研究对象空腹肘静脉血2.0 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中。根据文献[11]的方法，利用实时荧光定量PCR技术检测线粒体DNA拷贝数(mtDNAcn)，并进行相对mtDNAcn的计算。采用QuantiNAVA SYBR Green PCR Kit试剂盒测定线粒体基因mtND1和内参基因人β-球蛋白基因(Human β-Globulin，HBG)的Ct值。
引物序列详见表 1。反应程序为95℃、3 min激活DNA聚合酶，35个循环(每个循环包括95℃、15 s变形以及60℃、60 s退火和延伸)。每个样本的相对mtDNAcn = CtHBG － CtmtND1(其中CtHBG为该样本内参基因HBG的Ct值，CtmtND1为该样本目的基因mtND1的Ct值)。
表 1 mtND1基因和内参基因HBG引物序列基因 引物序列（5' → 3'） mtND1 前引物（F）：CAC CCA AGA ACA CCC TTT GT 后引物（R）：TGG CCA TGG GTA TGT TGT TA HBG 前引物（F）：GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC 后引物（R）：CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 1.2.3 统计学分析
使用Excel建立数据库，利用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。不符合正态分布的计量资料采用中位数和第25、75百分位数[M(P25，P75)]表示；符合正态分布的采用均数±标准差(x ± s)表示，组内前后差异比较采用配对t检验；三组及以上重复测量资料的组间差异采用重复测量的单因素方差分析；应用广义估计模型对线粒体DNA拷贝数的影响因素进行多因素分析。检验水准α = 0.05。
2. 结果
2.1 研究对象一般情况
150名研究对象均为男性。追踪开始时间为2018年，研究对象的年龄均数为42(40，47)岁，接苯工龄均数为21(19，28)年；吸烟94人，占62.7%，饮酒92人，占61.3%。
2.2 研究对象苯接触情况
工人作业车间主要包括粗苯制造和纯苯生产两个区域，主要作业内容包括作业区人工巡检、中间品及成品人工取样、原料及产品人工装卸车。作业人员现场操作时间约为4 h/班，生产班制为四班三运转。根据作业现场苯的检测结果，研究对象在本次追踪期间的苯接触浓度均数为0.46 (0.14，0.49)mg/m3。
2.3 研究对象相对mtDNAcn变化情况
经检验，150名研究对象两年检测的相对mtDNAcn结果均为正态分布，对2018、2019年的苯接触工人相对mtDNAcn进行分类统计，结果显示：2018、2019年相对mtDNAcn均值分别为5.79 ± 0.84、4.66 ± 0.58，差异具有统计学意义(t = 52.339，P < 0.01)。
2.4 苯接触工人mtDNAcn及其影响因素分析
2.4.1 相对mtDNAcn与低浓度苯接触浓度的关系
将对象按照接触浓度分为高(> 0.49 mg/m3)、中(> 0.14 ~ 0.49 mg/m3)、低(≤ 0.14 mg/m3)接触组三组，将接触浓度作为组间效应进行分析。不同接触浓度、不同年份相对mtDNAcn检验结果见表 2。利用重复测量方差分析，统计相对mtDNAcn与低浓度苯接触浓度的关系，结果显示：(1)球形检验结果拒绝球形对称的原假设(χ2 = 62.01，P < 0.05)，因此进一步的分析采用多变量分析的结果；(2)多变量分析结果中，时间效应为F = 152.80(P < 0.05)，即不同时间观察的mtDNAcn不全相同，差异有统计学意义；时间与组间无交互效应(F = 1.25，P > 0.05)；(3)主体间效应的检验结果显示，不同接触浓度研究对象的相对mtDNAcn差异有统计学意义(F = 3.53，P < 0.05)。
表 2 与低浓度苯接触浓度的关系分组 例数 相对mtDNAcn 2018年 2019年 高接触浓度组 24 5.81 ± 0.79 4.81 ± 0.46 中接触浓度组 67 5.62 ± 0.86 4.58 ± 0.59 低接触浓度组 59 5.97 ± 0.80 4.68 ± 0.59 2.4.2 相对mtDNAcn的影响因素分析
以广义估计模型方法分析低浓度苯接触工人接触浓度、工龄、年龄、吸烟和饮酒对相对mtDNAcn的影响，其中mtDNAcn为连续型数值变量，选择函数类型为线性模型。统计结果显示：与高接触浓度组相比，中接触浓度组工人相对线粒体DNA拷贝数降低了0.25，接触浓度是影响相对mtDNAcn的影响因素(P < 0.05)。此外，尚未发现工龄、年龄、吸烟和饮酒对相对mtDNAcn的影响。见表 3。
表 3 影响相对mtDNAcn变化的多因素广义估计模型分析因素 例数 SE值 χ2值 P值 β(95% CI)值 接触浓度/
(mg/m3)低 59 0.13 0.29 0.59 0.07(- 0.18，0.31) 中 67 0.09 7.77 < 0.01 - 0.25(- 0.42，- 0.07) 高 24 参照组 年份 2018年 150 0.08 194.97 < 0.01 1.13(0.97，1.29) 2019年 150 参照组 年龄/岁 < 40 52 0.17 2.27 0.13 0.26(- 0.08，0.61) 40 ~ 47 55 0.14 0.04 0.85 0.03(- 0.25，0.30) > 48 43 参照组 工龄/年 < 21 46 0.18 0.85 0.36 - 0.17(- 0.52，0.19) 21 ~ 27 52 0.14 0.54 0.46 - 0.11(- 0.38，0.17) > 28 52 参照组 吸烟 不吸 56 0.09 0.13 0.72 0.03(- 0.15，0.22) 吸 94 参照组 饮酒 不饮 58 0.10 1.09 0.30 0.10(- 0.09，0.30) 饮 92 参照组 3. 讨论
苯作为高毒物质和明确的致癌物，目前生产过程中已经尽量被低毒物质代替。但近年来，苯中毒人数仍一直高居我国上报职业病人数的前三位，苯致白血病也是我国发病最多的职业肿瘤之一[12]。
对遗传物质的损伤是目前公认的苯及其代谢物对人体健康损伤的主要原因，但由于其多种代谢产物的存在，苯对遗传物质的具体作用机制尚不清楚。目前国内外学者在表观遗传、基因多态性等方面都进行了有意义的探索，但对于线粒体氧化应激与苯接触关系的人群研究在国内尚未开展。
人类线粒体DNA是一具有16 569个碱基对的双链闭环分子，它包含22个tRNA基因、2个rRNA基因和13个有关线粒体氧化磷酸化的多肽基因[13]。有理论认为，虽然人体具有内源性抗氧化防御系统对致癌物代谢产物活性氧(reactive oxygen species，ROS)的消除能力，但当受到的相对攻击数量超过机体自身的抗氧化能力时，会导致氧化应激的出现，轻度氧化应激可损伤线粒体氧化呼吸链，刺激线粒体及mtDNA分子的代偿性变化，如有铅与外周血线粒体DNA拷贝数的研究认为，其与p53和PGC-1α的通路激活有关[14-15]，出现线粒体DNA多拷贝数现象以应对氧化应激所导致的损伤[16]，从而保证线粒体呼吸功能以及细胞的存活、损伤修复所需能量。
本次研究结果显示，2019年被检测工人外周血淋巴细胞中的线粒体DNA拷贝数相比2018年有明显的降低(P < 0.01)。重复测量方差分析结果显示：(1)高、中、低三组接触浓度之间线粒体DNA拷贝数差异有统计学意义(P < 0.05)。提示作业人员在低浓度苯接触的情况下，苯代谢产物活性氧(ROS)可能对线粒体造成了影响和损伤，但本次研究未观察到线粒体DNA拷贝数的升高，而是出现波动现象，其可能的原因是研究对象体内受到的氧化应激损伤已超过轻度损伤时线粒体功能代偿增加的阶段，氧化应激导致ROS的增加和氧化损伤的进一步加剧；当超过某一阈值时，导致线粒体功能障碍甚至细胞死亡[17]。(2)不同时间观察的mtDNAcn不全相同，差异有统计学意义。该结果与接触浓度对线粒体DNA拷贝数的影响相呼应。2019年被检测工人外周血淋巴细胞中的线粒体DNA拷贝数相比2018年有明显的降低，可能与本次研究对象多为该厂长期固定作业工人，接触苯作业时间较长，其线粒体功能受损程度较深有关，可能进展为线粒体拷贝数逐渐降低的阶段。此外有多项研究也表明，苯、多环芳烃和无机砷等致癌物在导致外周血线粒体DNA拷贝数发生变化时，不同研究结果间呈现不同的变化趋势[18-20]。本研究中的苯与线粒体DNA拷贝数的结果与前期提到的铅及其线粒体DNA拷贝数的变化趋势有所不同，也可能与该化学毒物本身的作业机制不同有关，该结果有待进一步探讨。
通过多因素广义估计模型统计分析发现：(1)中接触浓度组与高接触浓度组工人之间线粒体DNA拷贝数差异有统计学意义(P < 0.05)，而低接触浓度组与高接触浓度组之间差异无统计学意义(P > 0.05)，提示在接触浓度与线粒体DNA拷贝数存在关联的基础上，随着接触剂量的增加，线粒体DNA拷贝数的变化不是在一个方向上一成不变，其变化过程可能存在拐点，这一发现有待后续研究证实。(2)工龄、吸烟、饮酒、年龄对线粒体DNA拷贝数的变化均未成造成影响，这与既往研究中发现的吸烟、饮酒、年龄与线粒体DNA拷贝数之间存在关系的研究结果[21-23]不一致，可能的原因是工龄、吸烟、饮酒、年龄均为长期作用效果，一年之间两次的重复测量尚未能显现其相互的关系，后续研究中可增加重复测量次数和追踪时间，做进一步的研究。
目前多项研究显示，除了苯代谢物与DNA直接形成加合物[24-25]造成遗传损伤外，苯及其代谢产物活性氧ROS释放也是可能造成机体遗传物质氧化损伤的途径之一[26-27]。本研究采用了纵向追踪研究的方法，通过工人自身的前后对照，表明接触低浓度苯的作业工人仍可出现相对线粒体DNA拷贝数的改变。本次研究结果从人群研究角度提示了职业性苯暴露可能导致线粒体损伤以及氧化应激的产生，但其作用机制及其与苯所致遗传损伤的关系有待进一步研究。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 mtND1基因和内参基因HBG引物序列
基因 引物序列（5' → 3'） mtND1 前引物（F）：CAC CCA AGA ACA CCC TTT GT 后引物（R）：TGG CCA TGG GTA TGT TGT TA HBG 前引物（F）：GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC 后引物（R）：CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 
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表 2 与低浓度苯接触浓度的关系
分组 例数 相对mtDNAcn 2018年 2019年 高接触浓度组 24 5.81 ± 0.79 4.81 ± 0.46 中接触浓度组 67 5.62 ± 0.86 4.58 ± 0.59 低接触浓度组 59 5.97 ± 0.80 4.68 ± 0.59
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表 3 影响相对mtDNAcn变化的多因素广义估计模型分析
因素 例数 SE值 χ2值 P值 β(95% CI)值 接触浓度/
(mg/m3)低 59 0.13 0.29 0.59 0.07(- 0.18，0.31) 中 67 0.09 7.77 < 0.01 - 0.25(- 0.42，- 0.07) 高 24 参照组 年份 2018年 150 0.08 194.97 < 0.01 1.13(0.97，1.29) 2019年 150 参照组 年龄/岁 < 40 52 0.17 2.27 0.13 0.26(- 0.08，0.61) 40 ~ 47 55 0.14 0.04 0.85 0.03(- 0.25，0.30) > 48 43 参照组 工龄/年 < 21 46 0.18 0.85 0.36 - 0.17(- 0.52，0.19) 21 ~ 27 52 0.14 0.54 0.46 - 0.11(- 0.38，0.17) > 28 52 参照组 吸烟 不吸 56 0.09 0.13 0.72 0.03(- 0.15，0.22) 吸 94 参照组 饮酒 不饮 58 0.10 1.09 0.30 0.10(- 0.09，0.30) 饮 92 参照组
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