Identification of serum biomarkers change in benzene-exposed mice for 28 days
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+ English摘要:目的 观察28 d苯染毒小鼠血清蛋白的表达变化，寻找其敏感生物标志物。方法 选择4~5周龄雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级昆明小鼠40只，将其随机分为苯中毒组和对照组，苯中毒组30只，给予苯皮下注射，1次/d，剂量为每千克体质量150 mg（即150 mg/kg），每周5 d，连续4周。对照组10只，按同样方法给予玉米油。染毒期间记录小鼠皮毛外形、精神、饮食状况和体质量变化。实验结束时采集血液，进行血常规检测、血清生化肝功能指标检测、α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）、载脂蛋白A1（APOA1）及补体C3的检测；收集小鼠肝脏组织并称重，计算肝脏脏器系数，采用HE染色进行病理分析。结果 与对照组比较，苯中毒组实验期间小鼠皮毛外形、精神、饮食状况未见明显异常，染毒4周后，苯中毒组小鼠体质量低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；苯中毒组血红蛋白以及白细胞计数、红细胞计数和血小板计数均低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；苯中毒组的总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；肝脏组织病理学检查显示，两组小鼠均有不同程度的肝细胞糖原蓄积；苯中毒组APOA1水平高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论 皮下注射是建立苯染毒小鼠模型的简单可行的方法。在苯中毒小鼠模型中，APOA1蛋白表达上调，可能是潜在的苯中毒敏感生物标志物。
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尘肺病是由于长期吸入生产性粉尘而引起以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病。肺纤维化周边部位因代偿性充气过度造成泡性气肿，泡性气肿融合成为肺大泡。发生在脏层胸膜下肺大泡破裂或纤维组织牵拉、收缩，导致气体进入胸腔就发生了气胸。气胸在尘肺病并发症中占5%，在死亡率中排名第3位[1]。有文献报道气胸的复发与患者营养不良状况相关，营养不良者容易发生气胸[2]。我们就尘肺病并发自发性气胸患者营养状况对其健康的影响进行分析，剖析气胸发生的可能原因，以期尽可能减少该类患者气胸的发生。
1. 对象与方法
1.1 对象
以2016年1月—2020年3月苏州市第五人民医院职业病科收治的114例男性尘肺病患者为研究对象，其中气胸患者30例，归入尘肺病并发自发性气胸组；其余84例患者归入单纯尘肺病组。本次研究排除并发糖尿病、慢性失代偿性肺心病、甲状腺疾病以及4周内发生过感染、发热、活动性结核的患者。本次研究已通过单位的伦理审查。
1.2 方法
1.2.1 诊断依据
尘肺病的诊断符合GBZ 70—2015《职业性尘肺病的诊断》 [3]。气胸经胸片或胸部CT检查确诊。
1.2.2 观察指标
记录每例研究对象年龄、身高、体质量、血压，并计算体质量指数（body mass index，BMI），记录气胸发生后一周内总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖等生化指标检查结果，并结合人体营养指标血清白蛋白、血红蛋白、红细胞计数进行分析[4-5]。本研究将连续或累计吸烟6个月或以上者定义为吸烟者；每人每天盐的摄入量在6 g以上定义为嗜盐；每次饮酒摄入超过10 g酒精定义为饮酒。
1.2.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示，偏态分布的计量资料使用中位数和四分位数[M（P25 ~ P75）]表示。符合正态分布且方差齐的计量资料，两组间比较采用两独立样本t检验，不符合正态或方差不齐时采用Mann-Whiney U法或Wilcoxon检验；计数资料采用率或构成比表示，率的比较采用χ2检验。采用多因素logistic回归分析来评估相关指标对尘肺病并发自发性气胸的影响。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 研究对象一般临床资料
114例患者中，尘肺病并发自发性气胸组的年龄、体质量、身高、体质量指数（BMI）、血清钠、血清白蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸、平均病程均低于单纯尘肺病组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。尘肺病并发自发性气胸组在嗜盐、饮酒人数的占比均高于单纯尘肺病组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。尘肺病并发自发性气胸组尘肺病期别分布与单纯尘肺病组不同，差异有统计学意义（P < 0.05），其中尘肺病并发自发性气胸组尘肺病叁期的占比最高。见表 1。
表 1 两组尘肺病患者一般临床资料项目 尘肺并发自发性气胸组(n = 30) 单纯尘肺组(n = 84) t、z或χ2值 P值 年龄/岁① 64(50~70) 68(64~75) 2.881 0.004 身高/cm① 168.5(165.0 ~ 171.2) 162.5(158.0 ~ 170.0) 3.143 0.002 体重/kg② 54.98 ± 8.98 61.50 ± 11.66 3.142 0.003 BMI/(kg/m2)② 19.31 ± 2.88 22.96 ± 3.43 5.673 < 0.001 饮酒例数(占比/%) 16(53.3) 26(31.0) 4.759 0.029 吸烟例数(占比/%) 11(36.7) 35(41.7) 0.230 0.632 嗜盐例数(占比/%) 16(53.3) 25(29.8) 5.333 0.021 总胆固醇/(mmol/L)② 4.32 ± 0.85 4.52 ± 1.09 0.920 0.359 尿酸/(μmol/L)② 281.49 ± 106.12 345.48 ± 113.75 2.781 0.007 血清钾/(mmol/L)② 4.10 ±0.50 3.94 ±0.40 1.806 0.074 血清钠/(mmol/L)② 140.49 ± 3.86 142.80 ±2.48 3.067 0.004 血清钙/(mmol/L)② 2.32 ± 0.20 2.34 ±0.17 0.453 0.651 血清白蛋白/g② 36.95 ± 4.28 40.39 ± 4.33 3.760 0.000 白细胞计数/(x 109/L)① 6.15(4.30 ~ 8.52) 6.00(4.82 ~ 7.50) 0.283 0.777 血红蛋白/(g/L)① 135.0(121.8 ~ 155.8) 139.0(127.2 ~ 147.8) 0.303 0.762 谷草转氨酶(U/L)① 19(17~31) 19(15~22) 1.922 0.055 谷丙转氨酶(U/L)① 14(12~22) 14(11~20) 1.061 0.289 空腹血糖/(mmol/L)① 4.99(4.20~5.46) 5.48(4.88 ~ 6.39) 3.131 0.002 甘油三酯/(mmol/L)① 0.87(0.66 ~ 1.19) 1.16(0.81~1.69) 2.384 0.017 肌酐/(μmol/L)① 61.75(52.7 ~ 72.7) 67.7(59.3 ~ 79.2) 2.011 0.044 尿素氮/(mmol/L)① 4.715(3.983 ~ 6.233) 5.345(4.405 ~ 6.478) 1.802 0.072 平均病程/年② 7.283 ± 4.425 12.696 ±3.700 5.993 < 0.001 尘肺期别例数（占比/%) 3.526 < 0.001 壹期 6(20.0) 36(42.9) 贰期 6(20.0) 31(36.9) 叁期 18(60.0) 17(20.2) 注：①偏态分布的计量资料使用M（P25 ~ P75）表示；②正态分布的计量资料采用（x ± s）表示。 2.2 尘肺病并发自发性气胸的影响因素分析
以是否发生气胸为响应变量（发生气胸= 1，没有发生气胸= 0），单因素分析中差异有统计学意义（P < 0.05）的变量为预测变量，进行多因素logistic回归分析，但因身高、体质量、BMI存在共线性（VIF均 > 30），故仅纳入BMI。回归结果显示：年龄、BMI、血清白蛋白、平均病程、尘肺病期别是尘肺病患者并发自发性气胸的独立预测因子。其中年龄大（OR = 0.803）、BMI高（OR = 0.534）、血清白蛋白高（OR = 0.546）、平均病程长（OR = 0.369）是尘肺病患者并发自发性气胸的保护因素（P < 0.05）；而尘肺期别高（尘肺叁期）（OR = 126.914）是尘肺患者并发自发性气胸的危险因素（P < 0.05）。见表 2。
表 2 并发气胸的多因素logistic回归分析因素 β值 SE值 Wald χ2值 OR(95%CI)值 P值 年龄 -0.220 0.106 4.291 0.803(0.652 ~ 0.988) 0.038 BMI -0.628 0.295 4.537 0.534(0.300 ~ 0.951) 0.033 嗜盐 4.173 2.250 3.440 64.913(0.789 ~ 5 340.891） 0.064 饮酒 3.950 2.042 3.743 51.954(0.950 ~ 2 841.949) 0.053 尿酸 -0.003 0.006 0.345 0.997(0.986 ~ 1.008) 0.557 血清钠 0.262 0.257 1.041 1.300(0.785 ~ 2.151) 0.308 血清白蛋白 -0.606 0.275 4.865 0.546(0.319 ~ 0.935) 0.027 空腹血糖 -0.341 0.383 0.793 0.711(0.335 ~ 1.507) 0.373 甘油三酯 -2.064 1.233 2.803 0.127(0.011 ~ 1.422) 0.094 平均病程 -0.996 0.369 7.306 0.369(0.179 ~ 0.760) 0.007 尘肺期数(以壹期为参照） 贰期 1.885 1.816 1.077 6.586(0.187 ~ 231.627) 0.299 叁期 4.844 2.292 4.467 126.914(1.422 ~ 11 326.193) 0.035 3. 讨论
随着病情的加重，尘肺病患者呼吸功能下降，并发症增多，尘肺病患者营养不良因素不断增加，同时营养不良使呼吸肌结构和功能受损，导致通气功能严重障碍，进而降低全身防御和免疫功能，诱发感染，加重呼吸衰竭。而尘肺病并发气胸的病理原因是肺间质广泛的纤维组织增生，肺弹性减退，使肺组织在纤维团块周边出现代偿性肺气肿，甚至转变为代偿性肺大泡[2]。患者也可在剧烈咳嗽、用力过度、屏气的过程中引起肺大泡破裂从而发生气胸。
尘肺病患者由于其肺间质广泛的纤维组织增生导致呼吸功能减退，平时容易反复发生细菌感染、炎症反应、呼吸困难，使机体分解代谢增加，炎症因子、氧化应激反应、长期缺氧可引起胃肠道淤血，消化吸收减少，加之患者焦虑、恐惧等心理因素，进食量明显减少，且饮食较为清淡，出现线粒体功能缺失[6]，影响细胞色素氧化酶活力，导致营养不良[2]。本次研究结果显示，BMI、血清白蛋白水平偏低的尘肺病患者容易发生气胸，且尘肺病并发自发性气胸患者营养不良较单纯尘肺病患者更为明显，并发气胸的患者多为身长体瘦即低BMI的患者，主要表现为体质量、血清白蛋白明显偏低[7]，多种研究认为此类体型人群的气胸与其胸腔解剖有关，尤其是身材狭长者的胸腔更容易发生气胸[8-9]。有研究表明，低蛋白血症尤其是严重低蛋白血症（人血白蛋白水平 < 25 g/L）是慢性感染性疾病等一些危重症的潜在不良预后指标[10]。通过改善全身营养状况，提高血清白蛋白水平，可改善肺泡组织的局部营养，促进肺组织的修复，减少肺部并发症的发生率[11-12]；加强营养如提高血清白蛋白水平等可避免低BMI，从而在一定程度上预防气胸发生[13]。因此，及时发现患者存在的营养风险，有效地进行营养支持，指导患者平时饮食结构，是减少尘肺病患者并发气胸的一种经济、有效的方法。
本次研究也发现尘肺病患者气胸的发生率并没有随着患者的年龄和病程的增加而变化，甚至有降低的可能（P < 0.05），这可能和本次调查的尘肺病并发气胸组中，患者年龄分布不均，并非以年龄大、患病时间长的患者为主，而且对患者接尘浓度等没有调查有关。该组患者中年龄最小的29岁，此例患者系人造石英石切割工人。接触高游离二氧化硅粉尘，具有接尘年限短、尘肺期数高的特点[14]。该组患者虽不全是人造石英石切割工人，但部分患者工作性质与此类似，接尘浓度高、病情发展快。有研究显示暴露于高浓度游离二氧化硅粉尘下产生的影响是长期低浓度接触的3倍[15]。若劳动者对尘肺病认识不足，在日常工作中不注重防护，极易加快尘肺病进展。因此，加强职业病相关法律法规宣传，提高职工自我保护意识和维权能力；规范劳动合同管理工作，督促用人单位落实责任，定期进行职业健康体检，对接尘工人及早进行有针对性的防治[16]，都可以在控制尘肺病的同时减少气胸的发生率。而尘肺病叁期是尘肺病患者发生气胸的危险因素。分析其可能的原因是随着尘肺病的进展，肺组织和胸膜弹性显著降低，尘肺病患者出现肺通气/血流比例显著降低，导致患者出现血氧饱和度降低，肺组织代偿性的肺气肿进一步加重，一旦有各种诱因便会导致肺大泡破裂而出现自发性气胸[17-18]。
综上所述，对于尘肺病患者平时加强蛋白质类营养补充，适当增加体重，减缓尘肺病的进展，可以尽量预防自发性气胸的发生。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 苯中毒组与对照组染毒不同阶段体质量
（x ± s，g） 组别 例数 染毒前体质量 染毒1周后体质量 染毒2周后体质量 染毒3周后体质量 染毒4周后体质量 苯中毒组 28 35.56 ± 1.58 40.56 ± 2.43 42.69 ± 2.44 44.38 ± 2.66 45.50 ± 2.62 对照组 10 35.99 ± 1.26 40.71 ± 1.67 44.12 ± 2.02 45.94 ± 2.31 47.69 ± 2.37 t值 - 0.78 - 0.17 - 1.66 - 1.64 - 2.32 P值 0.44 0.86 0.11 0.11 0.03 
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表 2 苯中毒组与对照组染毒4周后全血细胞检测结果
组别 例数 白细胞计数/（×109/L） 红细胞计数/（×1012/L） 血红蛋白/（g/L） 血小板计数/（×109/L） 苯中毒组 28 4.31 ± 1.30 9.82 ± 0.61 149.50 ± 6.66 625.00 ± 164.05 对照组 10 5.61 ± 1.28 11.17 ± 0.73 164.60 ± 7.57 825.00 ± 82.78 t值 - 2.70 - 5.75 - 5.94 - 3.67 P值 0.01 < 0.01 < 0.01 0.01
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表 3 苯中毒组与对照组染毒4周后生化指标结果
（x ± s） 组别 例数 总蛋白/（g/L） 白蛋白/（g/L） 球蛋白/（g/L） 总胆红素/（μmol/L） 直接胆红素/（μmol/L） 苯中毒组 28 58.57 ± 5.91 18.57 ± 3.56 40.00 ± 4.71 2.93 ± 0.86 1.11 ± 0.31 对照组 10 57.00 ± 8.23 16.00 ± 5.16 41.00 ± 7.38 2.90 ± 0.99 1.20 ± 0.42 t值 0.65 1.74 - 0.49 0.09 - 0.73 P值 0.52 0.09 0.63 0.93 0.47 组别 例数 间接胆红素/（μmol/L） 谷丙转氨酶/（U/L） 谷草转氨酶/（U/L） 碱性磷酸酶/（U/L） 苯中毒组 28 1.82 ± 0.72 40.00 ± 15.63 76.79 ± 31.51 102.86 ± 27.74 对照组 10 1.80 ± 0.79 50.00 ± 12.47 76.00 ± 25.47 111.00 ± 17.29 t值 0.08 - 1.82 0.07 - 0.92 P值 0.94 0.08 0.94 0.39
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表 4 苯中毒组与对照组染毒4周后血清蛋白结果
（x ± s，g/L） 组别 例数 APOA1 α1-AT 补体C3 苯中毒组 28 21.55 ± 4.38 7.31 ± 0.83 1.28 ± 0.17 对照组 10 16.63 ± 3.20 7.28 ± 0.49 1.19 ± 0.16 t值 3.24 0.11 1.52 P值 < 0.01 0.92 0.14
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