锡广泛用于工业、农业和食品加工等领域。目前，我国尚没有血液中锡的标准检测方法、正常参考值范围以及职业接触生物限值。为了更准确地检测人体内的锡含量，评估锡对机体的影响，提高诊断的准确性，须建立一套准确定量血、尿中锡含量的成熟测定方法。现阶段各实验室主要是借用水质和食品中锡的测定方法，对病人的血、尿中锡进行测定，其中研究较多的测定方法主要为可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法以及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法。然而，ICP-MS仪器昂贵，试剂耗材成本高，难以在基层推广；石墨炉原子吸收光谱法需要基体改进剂，且不同类型的石墨炉技术之间具有较大的差异，检出限和精密度均不如原子荧光光谱法。尿锡检测相对简单，现在生物材料中主要以测定尿锡为主^[1-2]。血锡相对于尿锡不易受液体摄入量和肾功能等因素的影响，因此是评估机体锡负荷的重要指标，然而由于血中锡并非全是以游离状态存在的，而且血液中含有的有机成分和无机盐也有可能造成检测的偏差，因此血液的消解手段在血锡检测中至关重要。本研究拟通过对不同种类酸的消解体积、组合比例和消化时间等实验条件进行优化，建立一种简单且安全的血中锡湿式消解实验方法，现将结果报告如下。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   仪器设备

原子荧光光度计（AFS-9800型，北京海光仪器有限公司）；锡元素（Sn）空心阴极灯（北京有色金属研究总院）；石墨消解仪（DS-360型，广州格丹纳仪器有限公司）；超纯水机（Milli-Q型，美国Millipore公司）。

1.1.2   主要试剂

锡标准溶液[GSBG62042-90（5001），国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院]，500 mg/mL；硫脲（国药集团化学试剂有限公司），分析纯；抗坏血酸（广州化学试剂厂），分析纯；硼氢化钾，天津市大茂化学试剂厂，分析纯；质量分数30%的过氧化氢，天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯；氢氧化钠，广州化学试剂厂，分析纯；硫酸，广州化学试剂厂，优级纯；盐酸，广州化学试剂厂，优级纯；硝酸，广州化学试剂厂，优级纯。

1.2   方法

1.2.1   仪器主要参数

光电倍增管负高压：250 V；灯电流：80 mA；原子化器高度：8 mm；屏蔽气流量：1 000 mL/min；载气流量：400 mL/min。以标准曲线法测量，以峰面积积分读数，延迟时间为1 s，读数时间为22 s，进样体积为1.00 mL。

1.2.2   标准系列配制

使用锡标准溶液配制浓度为200.00 μg/L的锡标准应用液，应用仪器自动稀释配制成锡质量浓度依次为4.00、10.00、20.00、50.00、80.00、100.00、120.00、160.00和200.00 μg/L的标准系列。

1.2.3   前处理方法

（1）消化反应条件的选择：由于血液中的成分比尿液复杂，血红蛋白等有机成分较多，单一的消化液很难完成样品的消化。在本研究中，取1 mL全血，与硝酸、盐酸、硫酸和过氧化氢按不同比例混合，置于石墨消化仪中以90 ℃的消化温度处理血样。

（2）掩蔽剂的使用：用天平准确称取硫脲20 g，用50 ℃去离子水溶解稀释，并定容至100 mL，制备200 g/L硫脲溶液。在室温下将已冷却的硫脲溶液与200 g/L的抗坏血酸混合，制备硫脲-抗坏血酸混合溶液。血样消化后，加掩蔽剂（硫脲-抗坏血酸混合溶液）1.0 mL，用盐酸溶液（体积分数4%）稀释并定容至10 mL，待测。

（3）载流和还原剂：本研究选用盐酸溶液（体积分数4%）作为载流，硼氢化钾溶液作为还原剂。硼氢化钾溶液配制方法：称取2.0 g硼氢化钾固体，用氢氧化钾溶液溶解并稀释至100 mL。氢氧化钾溶液配制方法：称取0.5 g氢氧化钾固体，用纯水溶解并稀释至100 mL。

1.2.4   精密度实验

精密度分为批内精密度和批间精密度，是衡量一种方法的测试结果是否良好的指标。GBZ/T 210.5—2008《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质测定方法》 ^[3]要求在标准曲线的测量范围内选择高、中、低3种浓度，在3 ~ 5 d内重复测量6次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），要求RSD ≤ 10%。本研究的具体操作方法如下：

（1）批内精密度：将空白抗凝全血分为3组，每组6份，每份1.00 mL。第1组每份样品加入5.00 μg/mL的标准储备液20 μL，第2组和第3组每份样品分别加入50.00 μg/mL锡标准储备液10 μL和20 μL，制备成质量浓度为10.00 μg/L、50.00 μg/L和100.00 μg/L的低、中和高浓度的血液样品。上述各组样品按照本研究已优化的前处理方法进行消化和稀释，并在1 d内完成测定，计算待测组分批内精密度的RSD。

（2）批间精密度：批间精密度实验的分组和前处理方法同批内精密度，在6 d内进行6次测量。计算待测组分批间精密度的RSD。

1.2.5   准确度实验

使用准确度实验来检验本研究优化方法的系统误差和随机误差，评估其可靠程度。根据GBZ/T 210.5—2008《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质测定方法》 ^[3]的有关技术要求，准确度试验可采用加标回收法、标准物质法和比对法等。本研究选用加标回收法进行准确度实验。将已知浓度的待测物加入样品中，并一起测试加标样品和空白样品。将测定结果与已知加入量进行比较，用加标回收率进行评价。

将空白抗凝全血分为4组，每组6份，每份1.00 mL；除空白样品外，加标样品的配制方法同精密度实验，制备成质量浓度为10.00 μg/L、50.00 μg/L和100.00 μg/L的低、中和高浓度的血液样品，按照本研究已优化的前处理方法进行消化、稀释和测定，所得结果按以下公式计算其加标回收率：

2.   结果

2.1   前处理结果

本研究试验了3组消解组合：硝酸-盐酸-硫酸组合、硝酸-盐酸组合和硝酸-过氧化氢组合，并将消解质量分为A、B、C、D、E五级，定义如下：A级，消解后的样品呈现淡黄色、澄清、无凝块，使用稀盐酸溶液稀释后溶液澄清透明；B级，消解后的样品呈现浅黄色、澄清、无凝块，使用稀盐酸溶液稀释后溶液呈有絮状沉淀；C级，消解后的样品呈现深黄色、微浑浊、无凝块，使用稀盐酸溶液稀释后溶液呈乳白色浑浊；D级，消解后的样品呈现红褐色、浑浊、无凝块，使用稀盐酸溶液稀释后溶液呈乳白色浑浊；E级，消解后的样品呈现红褐色、有凝块，使用稀盐酸溶液稀释后溶液呈乳白色浑浊。

本研究首先使用硝酸-盐酸-硫酸组合（见表 1）和硝酸-盐酸组合（见表 2）于90 ℃进行消解，这两种消解组合在不同比例下均难以达到测定要求：即使经过3 ~ 4 h消解，样品黏度依然高；加入稀盐酸稀释后，样品依然因存有细小凝块，呈浑浊状态。加入硫脲-抗坏血酸后，均发生剧烈反应而喷出，造成待测元素的损失，也容易对原子仪器造成损伤。

表  1  硝酸-盐酸-硫酸消解组合

样品编号	全血体积/mL	硝酸体积/mL	盐酸体积/mL	硫酸体积/mL	消解时间/h	结果
1	1.00	0.50	0.25	0.50	4	E
2	1.00	0.50	0.50	0.50	3	E
3	1.00	1.00	0.50	0.50	3	D
4	1.00	1.00	1.00	0.50	3	D
5	1.00	2.00	1.00	0.50	3	C
6	1.00	2.00	2.00	0.50	3	B

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表  2  硝酸-盐酸消解组合

样品编号	全血体积/mL	硝酸体积/mL	盐酸体积/mL	消解时间/h	结果
1	1.00	0.50	0.25	4	E
2	1.00	0.50	0.50	3	E
3	1.00	1.00	0.50	3	D
4	1.00	1.00	1.00	3	D
5	1.00	2.00	1.00	3	B
6	1.00	2.00	2.00	3	B

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随后选用硝酸-过氧化氢组合于90 ℃进行消解，血液、硝酸和过氧化氢不同体积组合的消解结果见表 3。根据比对结果确定最优的消解方法：血1.00 mL，硝酸2.00 mL，过氧化氢2.00 mL于90 ℃消解1 h。随后对该优化的方法进行方法验证。

表  3  硝酸-过氧化氢消解组合

样品编号	全血体积/mL	硝酸体积/mL	过氧化氢体积/mL	消解时间/h	结果
1	1.00	0.50	0.25	4	E
2	1.00	0.50	0.50	4	D
3	1.00	1.00	0.50	3	C
4	1.00	1.00	1.00	3	B
5	1.00	2.00	1.00	1	A
6	1.00	2.00	2.00	1	A

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2.2   标准曲线与方法检出限

在优化的实验条件下，以原子荧光法测定锡，标准曲线在4.00 ~ 200.00 μg/L范围内线性良好，荧光强度随浓度增加而增大。线性回归方程为y = 34.17 x + 194.89（y：荧光强度，x：标准溶液浓度），相关系数R = 0.999 5。连续测定11次试剂空白，得出检出限为0.20 μg/L，定量下限为0.67 μg/L（分别以3倍和10倍标准差计算）。

2.3   检测结果评价

2.3.1   准确度和批内精密度

血锡低、中、高浓度组的加标回收率分别为105.72%、103.31%、99.76%，批内RSD为2.59%、0.46%、0.21%。见表 4。

表  4  血锡的批内精密度结果

加标	加标量/（μg/L）	测定值/（μg/L）	回收率/%	平均回收率/%	RSD/%
低浓度	10.00	10.80	108.02	105.72	2.59
	10.00	10.38	103.80
	10.00	10.82	108.18
	10.00	10.78	107.81
	10.00	10.49	104.94
	10.00	10.16	101.55
中浓度	50.00	51.57	103.14	103.31	0.46
	50.00	51.65	103.31
	50.00	52.01	104.02
	50.00	51.48	102.96
	50.00	51.37	102.74
	50.00	51.84	103.69
高浓度	100.00	99.42	99.42	99.76	0.21
	100.00	99.61	99.61
	100.00	99.83	99.83
	100.00	100.04	100.04
	100.00	99.83	99.83
	100.00	99.81	99.81

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2.3.2   批间精密度

血锡低、中、高浓度组6 d内6次测量获得的批间精密度相对标准偏差分别为2.25%、3.53%、9.72%。见表 5。

表  5  批间精密度实验结果

加标量/（μg/L）	测定值/（μg/L）						平均值/（μg/L）	RSD/%
	1	2	3	4	5	6
10.00	10.34	9.45	9.62	9.65	10.45	7.86	9.23	9.72
50.00	50.21	49.25	52.84	52.81	50.95	48.55	50.77	3.53
100.00	96.62	98.75	95.55	99.45	100.81	101.04	102.87	2.25

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2.4   掩蔽剂的使用以及干扰实验

在高、中、低浓度的加标样品中，分别加入高于血锡含量1 ~ 200倍的金属离子干扰物（100 μg/L ~ 20 mg/L），包括汞、锑、铝、锰、铅、锌、镉、铜、硒、铁等。实验通过重复10次测定加入掩蔽剂（硫脲-抗坏血酸混合溶液）的10、50和100 μg/L锡标准应用溶液与未加入掩蔽剂的标准液，比较两者的荧光响应强度。实验结果显示，加入掩蔽剂后，可抑制其他元素的干扰，并使荧光强度明显提高，由此可提高检测灵敏度。见表 6。

表  6  掩蔽剂对血中锡测定的影响

样品数	测量次数	加标量/（μg/L）	荧光强度
			未加入掩蔽剂	加入掩蔽剂
低浓度	10	10.00	426.59 ± 5.92	562.29 ± 5.95
中浓度	10	50.00	1 547.09 ± 7.20	1962.12 ± 12.18
高浓度	10	100.00	2 865.95 ± 10.24	3584.87 ± 33.93

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3.   讨论

常用于血液前处理的湿式消化体系主要有硝酸、硝酸-高氯酸组合、硫酸-硝酸组合、盐酸-硝酸-过氧化氢组合、硝酸-过氧化氢组合等。由于血液中成分较尿液复杂，血红蛋白等有机物成分较多，单一的消解液难以完成样品的消解，而现在对血中锡湿式消解法的相关研究多使用高氯酸^[4]。高氯酸是强氧化剂，遇有机物发生剧烈氧化反应，如处置不当容易因分解放热过快而发生爆炸。由于血液含有大量蛋白质等有机物，使用高氯酸有较高的爆炸风险，对实验人员的实验技能要求较高。因此本研究欲通过对高氯酸以外的各种不同种类酸消解体积、组合比例和消化时间等实验条件的优化，建立适用于基层实验室的简便且安全的血中锡湿式消解实验方法。

由于锡可以以多种形态存在于血液中，能否把不同形态的锡完全消解是准确定量血液中的锡的关键。此外，血中含有的有机和无机盐成分也可造成检测结果的偏差，其中无机盐中的阳离子铁、锌、硒等可产生负干扰，而铅、镉、铝等可产生正干扰，须使用掩蔽剂消除上述干扰，为此本研究使用硫脲-抗坏血酸混合溶液作为掩蔽剂，并分析了不同浓度的汞、锑、铝、锰、铅、锌、镉、铜、硒、铁等离子对砷测定可能产生的干扰。研究证明，加入掩蔽剂后，测定所得血中锡样品的荧光强度没有明显的变化。

本研究建立了优化的硝酸-过氧化氢湿式消解方法：血1 mL，硝酸2 mL，过氧化氢2 mL于90℃消解1 h。该方法在质量浓度为4.00 ~ 200.00 μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 5，方法检出限为0.20 μg/L，加标回收率为99.76% ~ 105.72%，批内精密度为0.21% ~ 2.59%，与使用高氯酸的湿式消解法^[4]和微波消解法^[5-6]相比较，无论在线性范围、准确度、批内精密度等方面，没有明显差异，并明显优于石墨炉原子吸收光谱法^[7]，而且本方法对消解仪器和实验人员的实验技能要求较低，非常适宜在基层实验室推广使用。该方法前处理简单，灵敏度高，线性范围广，成本低，其精密度、准确度、抗干扰性能等各项指标均满足GBZ/T 210.5—2008《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质测定方法》 ^[3]中对原子荧光光谱法的要求。我国尚没有血液中锡的标准检测方法，本研究进行了血中锡测定前处理方法的探索，可为今后制定血中锡测定的国家标准提供科学依据。