Optimization of wet digestion method for determination of tin in blood by atomic fluorescence spectrometry
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+ English摘要:目的 建立适合于基础实验室应用的原子荧光法测定血中锡时的湿式消解方法。方法 取人体1 mL全血，分别使用硝酸、盐酸、硫酸、过氧化氢以不同比例混合，置于石墨消解仪于90℃对血样进行消解，消解完成后加入200 g/L硫脲-抗坏血酸1 mL来掩蔽镍、铁、砷、硒等干扰离子，使用体积分数4%的盐酸溶液定容至10 mL，采用氢化物发生-原子荧光法测定锡浓度。结果 依据不同消解组合的结果，提出优化的湿式消解方法为硝酸2 mL加过氧化氢2 mL于90℃消解样品1 h。在此条件下，质量浓度在4.00~200.00 μg/L范围内，原子荧光法测定锡的标准曲线线性关系良好，相关系数为0.999 5；方法检出限为0.20 μg/L，加标回收率为99.76%~105.72%，批内精密度为0.21%~2.59%。结论 该湿式消解方法可使样品消解完全，待测元素损失少，基体干扰少，准确度和精密度较好，所用消解仪器便宜且在基层容易普及，适用于基层实验室对人血中锡浓度的测定。
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苯是工业生产中常用的原料之一。长期接触低浓度的苯可引起以造血系统损害为主要特征的慢性苯中毒，导致白细胞减少症、血小板减少症、再生障碍性贫血，甚至粒细胞性白血病、其他类型的白血病等疾病[1]，但其主要毒作用机制迄今尚未完全阐明[2]。研究表明苯的代谢物在体内产生超量自由基引起氧化损伤是造血系统损伤的重要原因[3]。自由基类标志物主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）和总抗氧化物状态（total antioxidant status，TAS）。本研究通过观察职业性慢性苯中毒患者自由基类标志物水平，探索其作为苯中毒潜在效应标志的可能性。
1. 对象与方法
1.1 对象
选择2019年1月—2021年4月深圳市职业病防治院就诊的38名轻度苯中毒患者作为病例组，并选择同期于院内进行健康体检人员38人作为对照组。病例组纳入标准：依据GBZ 68—2013《职业性苯中毒的诊断》[4]确诊为职业性慢性苯中毒患者。对照组纳入标准：体检结果健康者。排除标准：有苯接触史和线粒体相关疾病；有吸烟、饮酒史；有遗传疾病或家族史；有长期X线或其他放射线接触史[5]。本研究经深圳市职业病防治院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 试剂与仪器
超氧化物歧化酶测定试剂盒（底物法）、总抗氧化物状态测定试剂盒（比色法）、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒（紫外酶法）和谷胱甘肽还原酶测定试剂盒（紫外酶法）均购自山东中拓生物有限公司。可调定量加液器（德国赛默飞世尔科技公司）、XE- 5000血液分析仪[希森美康医用电子（上海）有限公司]、电动离心机[美国西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]、全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）。
1.2.2 自由基类标志物的测定
采集外周血5 mL，2 000 g离心力离心30 min，取血清作为检测样品。这些标志物测定均参考厂家提供的说明书和仪器说明书完成。
（1）超氧化物歧化酶（SOD）：取15 μL样品（校准）和225 μL R1试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100.0 mmol/L）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）（1.0 mmol/L）]进行混匀，37 ℃孵育3 ~ 5 min，读吸光度A1；再加入75 μL R2试剂[邻苯三酚（20.0 mmol/L）、牛血清白蛋白（1.0 g/L）、叠氮化钠（0.5 g/L）]混匀，37 ℃孵育5 min，读吸光度A2，计算△A = A2-A1，样品浓度=样品△A/标准△A ×标准浓度。
（2）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）：取10 μL样品（标准）和200 μL R1试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、谷胱甘肽（4 mmol/L）、谷胱甘肽还原酶（0.5 kU/L）、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）（0.18 mmol/L）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（0.5 mmol/L）]进行混匀，37 ℃孵育3 ~ 5 min，读吸光度A1；再加入50 μL R2试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、过氧化氢异丙基苯（0.18 mmol/L）] 混匀，延迟0.5 min，连续监测2 min，读吸光度A2，计算样品浓度=样品△A/标准△A ×标准浓度。
（3）谷胱甘肽还原酶（GR）：取10 μL样品（标准）和200 μL R1试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）（0.5 mmol/L）、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）（0.17 mmol/L）]进行混匀，37 ℃孵育3 ~ 5 min，读吸光度A1；再加入50 μL R2试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）（2.2 mmol/L）] 混匀，延迟0.5 min，连续监测2 min，读吸光度A2，计算样品浓度=样品△A/标准△A ×标准浓度。
（4）总抗氧化物状态（TAS）：取10 μL样品（标准）和200 μL R1试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（0.5 mmol/L）]进行混匀，37 ℃孵育5 min，读取吸光度A1；再加入50 μL R2试剂[三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（100 mmol/L）、碳酸钾（66.58 g/L）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（0.61 mmol/L）]混匀，延迟5 min，读吸光度A2，计算样品浓度=样品△A/ 标准△A ×标准浓度。
1.2.3 血常规的测定
采集外周血2 mL EDTA抗凝全血作为检测样品，使用XE-5000血液分析仪进行血常规检测。血常规各项参数采用基于流式细胞术和电阻抗原理的全自动血液分析仪检测分析，所使用的试剂耗材和质控品均为原装进口产品。
1.2.4 统计学分析
实验数据采用SPSS 16.0统计软件处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间差异比较采用独立样本t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。白细胞、血小板和总抗氧化物状态、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶浓度进行线性相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般特征
结果显示，病例组男性11人，女性27人，平均年龄（41.97 ± 6.70）岁；对照组男性14人，女性24人，平均年龄（40.34 ± 7.34）岁；病例组与对照组年龄、性别差异无统计学意义（t年龄 = 1.012，P = 0.315；χ性别2 = 0.536，P = 0.464）。
2.2 血常规水平
病例组白细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、红细胞计数均低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 1。
表 1 病例组与对照组血常规水平组别 白细胞/（× 109/L） 血小板/（× 109/L） 血红蛋白/（g/L） 红细胞/（× 1012/L） 病例组 3.44±1.26 175.82±56.48 121.0±16.86 4.08±0.61 对照组 6.75±2.17 266.66±66.31 138.82±20.80 4.92±0.64 t值 -8.007 -6.344 -4.109 -5.706 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 2.3 自由基标志物的表达水平
病例组总抗氧化物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及谷胱甘肽还原酶表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 2。
表 2 病例组与对照组氧化物的水平组别 总抗氧化物/（mmol/L） 超氧化物歧化酶/（U/mL） 谷胱甘肽过氧化物酶/（U/L） 谷胱甘肽还原酶/（U/L） 病例组 0.94 ± 0.30 118.13 ± 37.39 42.01 ± 13.85 44.67 ± 16.83 对照组 1.35 ± 0.31 144.79 ± 32.75 56.16 ± 12.62 55.26 ± 14.33 t值 - 5.706 - 3.243 - 4.952 - 2.913 P值 < 0.001 0.002 < 0.001 0.005 2.4 效应标志物与白细胞和血小板的相关性分析
相关分析结果显示：白细胞计数和谷胱甘肽还原酶，血小板计数和总抗氧化物、超氧化物歧化酶的表达水平均存在线性相关（r = 0.325、-0.332、-0.361，P = 0.047、0.041、0.026）。见图 1（a）~（d）。
3. 讨论
苯是国际上公认的具有血液毒性和致癌的物质[5]。目前对慢性苯中毒所导致的再生障碍性贫血、白血病等疾病还没有特效的治疗手段，因而早期诊断对于慢性苯中毒至关重要。目前，血常规检查是慢性苯中毒诊断常用的检测手段之一。在慢性苯中毒患者的造血系统中会出现红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板等血细胞指标减少等现象[6]。在本次研究中发现，相对于健康体检人员，38例慢性苯中毒患者的红细胞、白细胞、血小板的计数和血红蛋白含量明显降低（P < 0.01），这些现象符合苯中毒的临床表现。
本次研究还检测了慢性苯中毒患者和健康对照组的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、总抗氧化物这4项生化指标。抵抗活性氧（reactive oxygen species，ROS）超量生成需要多种抗氧化酶的协同作用。SOD是参与氧自由基生成过氧化氢的关键酶之一。SOD浓度的增加以对抗机体氧自由基升高造成的氧化损伤，是对机体预防靶器官损伤的保护作用[7]。谷胱甘肽过氧化物酶是人体内主要的抗氧化酶之一，可清除由ROS和超氧阴离子自由基诱发的脂质过氧化物[8]。动物实验表明谷胱甘肽过氧化物酶在防止脂质过氧化物方面起着重要作用，能保护细胞膜结构和功能的完整性，并降低细胞突变的发生率。研究表明谷胱甘肽过氧化物酶降低的主要原因可能由于化学中毒引起自由基升高，自由基对线粒体、内质网等细胞器的损伤，使组织合成谷胱甘肽过氧化物酶障碍，同时消耗也增多[9]。谷胱甘肽还原酶是人体氧化还原体系中最为重要的酶之一，是维持细胞中还原型谷胱甘肽含量的主要黄素酶。在NADPH参与下，氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽，后者在防止血红蛋白的氧化分解、维持巯基蛋白的活性、保证巯基蛋白的还原性及细胞的完整性具有重要的作用[10]。苯亲脂性很强，多聚集于细胞膜内，使细胞膜的脂质双层结构肿胀，影响细胞膜蛋白功能，干扰细胞膜的脂质和磷脂代谢，抑制细胞膜的氧化还原功能[11]。GR为巯基酶，GR失活可能与其活性必需的细胞膜的巯基被氧化有关。总抗氧化物状态是反应低浓度抗氧化剂有效抑制自由基氧化反应物质的能力，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应[12]。本研究发现病例组超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和总抗氧化物状态水平明显低于对照组，可能的原因是苯中毒病人因自由基升高导致抗氧化系统受到了损伤。由于血小板和白细胞是慢性苯中毒诊断的必要指标，本研究进一步地探讨了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、总抗氧化物表达水平和血小板、白细胞计数的相关性。相关性分析显示：白细胞计数与谷胱甘肽还原酶成正相关（P < 0.05），血小板计数与总抗氧化物状态和超氧化物歧化酶的表达水平上升趋势呈负相关（P < 0.05）。
综合以上结果，我们认为谷胱甘肽还原酶、总抗氧化物状态和超氧化物歧化酶可能是潜在的职业性苯中毒的生物标志，但因本次研究的样本量所限，仍需进一步的机制研究和大样本量人群调查证据支持。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 硝酸-盐酸-硫酸消解组合
样品编号 全血体积/mL 硝酸体积/mL 盐酸体积/mL 硫酸体积/mL 消解时间/h 结果 1 1.00 0.50 0.25 0.50 4 E 2 1.00 0.50 0.50 0.50 3 E 3 1.00 1.00 0.50 0.50 3 D 4 1.00 1.00 1.00 0.50 3 D 5 1.00 2.00 1.00 0.50 3 C 6 1.00 2.00 2.00 0.50 3 B 
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表 2 硝酸-盐酸消解组合
样品编号 全血体积/mL 硝酸体积/mL 盐酸体积/mL 消解时间/h 结果 1 1.00 0.50 0.25 4 E 2 1.00 0.50 0.50 3 E 3 1.00 1.00 0.50 3 D 4 1.00 1.00 1.00 3 D 5 1.00 2.00 1.00 3 B 6 1.00 2.00 2.00 3 B
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表 3 硝酸-过氧化氢消解组合
样品编号 全血体积/mL 硝酸体积/mL 过氧化氢体积/mL 消解时间/h 结果 1 1.00 0.50 0.25 4 E 2 1.00 0.50 0.50 4 D 3 1.00 1.00 0.50 3 C 4 1.00 1.00 1.00 3 B 5 1.00 2.00 1.00 1 A 6 1.00 2.00 2.00 1 A
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表 4 血锡的批内精密度结果
加标 加标量/（μg/L） 测定值/（μg/L） 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 低浓度 10.00 10.80 108.02 105.72 2.59 10.00 10.38 103.80 10.00 10.82 108.18 10.00 10.78 107.81 10.00 10.49 104.94 10.00 10.16 101.55 中浓度 50.00 51.57 103.14 103.31 0.46 50.00 51.65 103.31 50.00 52.01 104.02 50.00 51.48 102.96 50.00 51.37 102.74 50.00 51.84 103.69 高浓度 100.00 99.42 99.42 99.76 0.21 100.00 99.61 99.61 100.00 99.83 99.83 100.00 100.04 100.04 100.00 99.83 99.83 100.00 99.81 99.81
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表 5 批间精密度实验结果
加标量/（μg/L） 测定值/（μg/L） 平均值/（μg/L） RSD/% 1 2 3 4 5 6 10.00 10.34 9.45 9.62 9.65 10.45 7.86 9.23 9.72 50.00 50.21 49.25 52.84 52.81 50.95 48.55 50.77 3.53 100.00 96.62 98.75 95.55 99.45 100.81 101.04 102.87 2.25
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表 6 掩蔽剂对血中锡测定的影响
样品数 测量次数 加标量/（μg/L） 荧光强度 未加入掩蔽剂 加入掩蔽剂 低浓度 10 10.00 426.59 ± 5.92 562.29 ± 5.95 中浓度 10 50.00 1 547.09 ± 7.20 1962.12 ± 12.18 高浓度 10 100.00 2 865.95 ± 10.24 3584.87 ± 33.93
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1. 曾靖雯，郑丽辉，王志勇，柯宗枝. 苯暴露对女工生殖及其子代发育影响的Meta分析. 海峡预防医学杂志. 2024(03): 84-88 . 
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