雪上一枝蒿为毛茛科乌头属植物短柄乌头，主要分布在云、贵、川、藏、陕、甘、宁等地，尤其是云南的东川、会泽等地。雪上一枝蒿主要用于治疗跌打损伤、风湿骨痛等疾病，但其毒性较大，中毒患者发病快，因误服泡有雪上一枝蒿的药酒而导致中毒的案例时有报道^[1-3]。2018年5月重庆市某区发生了一起因误服雪上一枝蒿药酒而致多人中毒死亡的事件。因此，及时、准确检测出中毒患者生物检材中的毒性物质，为抢救和治疗提供科学、可靠的依据就尤为重要。

雪上一枝蒿品种繁多，如有短柄乌头、展毛短柄乌头、小白撑等^[4]，且成分复杂，含有多种剧毒物质，主要为二萜类生物碱及脂类生物碱^[5]，且因其产地不同所含生物碱种类亦有不同^[6-9]。因此，在成分如此复杂的雪上一枝蒿样品中，首先需要甄别其毒性较大的主要几种生物碱。其中，乌头碱为主要剧毒物质，一般中毒剂量为0.2 mg，致死量为2.0 ~ 4.0 mg^[10]。此外次乌头碱、新乌头碱、滇乌头碱、雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿乙素等也属于毒性较大的物质^[8-9]。

目前，针对全血中乌头碱类的检测方法已有报道^[11-12]，但灵敏度稍低，仅能满足中毒水平的检测，不能满足低含量的检测。而且针对全血中雪上一枝蒿中多种生物碱如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、滇乌头碱、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿乙素等的同时检测在有阅的文献中还未见这一内容的报道。因此，本研究拟采用高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）建立一种全血中同时测定雪上一枝蒿中6种生物碱（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿乙素）的快速、灵敏的方法，为临床抢救及治疗提供科学可靠的依据。

1.   材料与方法

1.1   仪器与试剂

Triple Quad 4500MD三重四极杆液相质谱联用仪（美国SCIEX公司）；SCIEX Jasper HPLC系列高效液相色谱仪（美国SCIEX公司），配备自动进样器和柱温箱；KQ-300 DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HC-2518型超高速离心机（科大创新股份有限公司）；UGC-24C水浴氮吹仪（北京优晟联合科技股份有限公司）。

乌头碱（质量分数98.01%）、次乌头碱（质量分数99.04%）、新乌头碱（质量分数98.12%）、滇乌头碱（质量分数98.02%）对照品，购自成都曼斯特生物科技有限公司；雪上一枝蒿甲素（质量分数≥ 98%）、雪上一枝蒿乙素（尼奥林）（质量分数≥ 98%）对照品，购自源叶生物；甲醇（HPLC级），购自Fisher Scien公司；乙酸铵（分析纯），购自Sigma公司；甲酸（色谱纯），购自Sigma公司。

1.2   方法

1.2.1   色谱条件

色谱柱：Waters C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm，色谱柱填料粒径1.7 μm）；甲醇: 甲酸水溶液（体积分数0.1%），流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量1 μL，梯度模式洗脱（以甲醇为准）：0 min，20%（以下百分数均为甲醇体积分数）；0.5 min，40%；3.0 min，90%；4.0 min，90%；4.1 min，20%；7 min，停止。

1.2.2   质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子扫描，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；离子喷雾电压（ionspray voltage，IS）5 500 V，辅助加热器温度（temperature，TEM）450 ℃，雾化气（ion source gas1，GS1）50 psi（1 kPa = 0.145 psi），辅助加热气（ion source gas 2，GS2）50 psi，破簇电压（declustering potential，DP）130 eV，气帘气（curtain gas，CUR）35 psi，碰撞气（collision gas，CAD）7 psi。碰撞能量见表 1。

表  1  6种生物碱的质谱条件

化合物	保留时间/min	定量离子对质荷比/定性离子对质荷比	碰撞能量/eV
乌头碱	3.07	646.4/586.3	46
		646.4/368.2	57
次乌头碱	3.03	616.3/556.3	44
		616.3/524.2	50
新乌头碱	2.95	632.2/572.2	45
		632.2/354.1	55
滇乌头碱	3.04	660.3/600.3	47
		660.3/568.3	54
雪上一枝蒿甲素	1.93	344.2/58.2	74
		344.2/91.2	88
雪上一枝蒿乙素	2.23	438.3/420.4	40
		438.3/388.2	42
注：以质荷比（m/z）586.3、556.3、572.2、600.3、58.2、420.4为定量特征离子，其丰度大小与各化合物含量成线性，样品采用第二离子对和保留时间定性后，阳性样品再利用第一离子对定量。

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1.2.3   样品前处理

（1）蛋白沉淀法：取0.5 mL全血样品，加入1 mL乙腈沉淀蛋白，摇匀后8 000 r/min（离心半径61 mm）离心5 min后取上清液，氮气吹干，用200 μL初始比例流动相复溶，用0.22 μm滤头过滤后，供测定。

（2）液液萃取法：取0.5 mL全血样品，加入1 mL乙醚∶二氯甲烷（体积比3∶2）混合溶液，充分振荡摇匀，8 000 r/min（离心半径61 mm）离心5 min后取上清液，氮气吹干，用200 μL初始比例流动相复溶，用0.22 μm滤头过滤后，供测定。

1.2.4   对照品溶液的配制

分别精密称取0.5 mg乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、滇乌头碱、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿乙素对照品，溶于少量甲醇溶液中，用甲醇定容至10 mL，配制成50 μg/mL的混合对照品溶液，临用前用甲醇稀释到所需浓度。

2.   结果与讨论

2.1   色谱行为

配制浓度为50 ng/mL乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、滇乌头碱、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿乙素的混标溶液，进样测定，6种生物碱的MRM色谱图见图 1。

图  1  6种生物碱的MRM色谱图

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2.2   质谱检测条件的研究

在调谐（tune）模式下，建立实验方法。在正离子检测模式下，将质量浓度200 ng/mL的对照品甲醇溶液直接进样分析，进行Q1全扫描和子离子扫描得到母离子和子离子，并依次对破簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、出口电压（CXP）等参数进行了优化，详见表 1。

2.3   样品前处理方法的优化

本实验考察了采用乙腈进行蛋白沉淀及采用乙醚: 二氯甲烷（体积比3∶2）混合溶液进行液液萃取两种前处理方法。通过实验可知，液液萃取法与蛋白沉淀法回收率相差不大，综合考虑回收率及临床救治时效性，选择乙腈蛋白沉淀法，结果见表 2。

表  2  6种生物碱前处理方法对比 （n = 3）

化合物	平均提取回收率/%
	液液萃取法	蛋白沉淀法
乌头碱	80.9	88.2
次乌头碱	82.4	88.5
新乌头碱	83.4	82.6
滇乌头碱	85.3	87.6
雪上一枝蒿甲素	88.5	89.7
雪上一枝蒿乙素	87.6	90.3

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2.4   标准工作曲线及定量限

取6份空白血样混合均匀，加6种化合物的混合对照品溶液，配制成浓度分别为0.5、1.0、5.0、10、50、100 ng/mL乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、滇乌头碱、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿乙素的混标溶液，按照1.2.3节进行样品前处理，进样测定，以峰面积对6种物质的质量浓度作线性回归。标准工作曲线在0.5 ~ 100 ng/mL范围内回归方程的线性系数均大于0.999 0，相关性良好。以5.0 ng/mL标准谱图，按10倍信噪比计算最低定量限，结果见表 3。

表  3  6种生物碱在血液中的回归方程及定量限

化合物	回归方程	相关系数	最低定量限/（ng/mL）
乌头碱	Y = 5 746.8X - 135.2	0.999 7	0.50
次乌头碱	Y = 18 293.8X - 728.1	0.999 7	0.26
新乌头碱	Y = 9 724.5X + 214.7	0.999 8	0.56
滇乌头碱	Y = 84 700X + 1 581.5	0.999 6	0.03
雪上一枝蒿甲素	Y = 631.7X + 1 261.3	0.999 9	0.30
雪上一枝蒿乙素	Y = 37 200X - 998.3	0.999 8	0.20

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2.5   提取回收率、准确度及精密度实验

分别配制高、中、低3个浓度（90、20、2 ng/mL）的血液加标样品，每个浓度平行配制6份，按照1.2.3节操作，连续测定6 d，测得相应峰面积，代入当天标准工作曲线，计算其浓度，以测得量与加入量之比计算方法准确度。另取全血样品，同法操作，获得空白基质溶液，加入高、中、低3个质量浓度（90、20、2 ng/mL）的标准工作溶液，进样分析获得相应的峰面积，根据两者峰面积计算提取回收率，结果见表 4。

表  4  6种生物碱在血液中的精密度、准确度、提取回收率及基质效应

化合物	质量浓度/（ng/mL）	日内精密度/%	日间精密度/%	提取回收率/%	准确度/%	基质效应/%
乌头碱	2	6.0	6.3	87.1	92.9	85.0
	20	1.9	2.1	86.2	105.8	80.3
	90	1.9	2.8	88.2	103.2	79.5
次乌头碱	2	2.4	3.2	85.8	97.4	92.1
	20	3.1	3.2	88.5	102.1	86.8
	90	1.9	2.1	85.5	102.4	81.5
新乌头碱	2	6.3	6.2	82.1	100.4	81.1
	20	2.7	3.0	82.2	105.8	83.8
	90	0.9	1.9	82.6	103.2	79.2
滇乌头碱	2	1.2	1.4	87.6	101.7	82.5
	20	2.2	2.7	85.1	105.3	86.8
	90	1.1	1.2	83.4	102.6	79.1
雪上一枝蒿甲素	2	6.0	6.3	88.9	98.9	91.1
	20	2.8	2.9	87.4	99.2	92.8
	90	2.0	2.4	89.7	99.5	93.5
雪上一枝蒿乙素	2	3.7	4.6	88.3	98.9	79.0
	20	1.9	2.5	88.7	105.1	83.0
	90	0.9	2.0	90.3	99.8	83.8

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2.6   基质效应考察

取15管空白全血各0.5 mL，除不加标准系列溶液外，按1.2.3节处理后，上层有机相用N₂吹干，残渣中分别加入高、中、低3个浓度（90、20、2 ng/mL）混标溶液各10 μL，每个浓度取5个平行样，用初始梯度流动相溶液稀释至200 μL，充分振摇使残渣溶解，0.22 μm过滤后，上机测定。用初始梯度流动相溶液配制相同浓度的标准溶液，进样测定。以此种方法测得的峰面积与相应浓度的标准溶液测得的峰面积的比值计算百分比，由结果可见基质对色谱峰影响较小。结果见表 4。

2.7   稳定性考察

按2.5节配制6种生物碱高、中、低3个浓度的血样加标样品，每个浓度3个平行样，经室温放置12 h、长期冻存（-20 ℃冻存15 d）、反复3次-20 ℃冰冻。室温溶解，按照建立方法以及标准工作曲线进行处理和分析，得到6种生物碱在血液中质量浓度的相对偏差均在15%以内，可见在上述保存条件下，6种生物碱在血液中含量变化不大，基本稳定。见表 5。

表  5  血液中6种生物碱的稳定性考察 （n = 3）

化合物	质量浓度/（ng/mL）	室温12 h			-20 ℃，15 d			-20 ℃冻溶3次
		测定质量浓度/（ng/mL）	相对偏差/%		测定质量浓度/（ng/mL）	相对偏差/%		测定质量浓度/（ng/mL）	相对偏差/%
乌头碱	2	1.92	- 4.0		1.73	- 13.5		1.88	- 6.0
20	20.3	1.5	18.1		- 9.5	19.2		- 4.0
90	89.5	- 0.6	84.5		- 6.1	88.9		- 1.2
次乌头碱	2	2.10	5.0		1.71	- 14.5		1.85	- 7.5
	20	19.7	- 1.5		17.4	- 13.0		18.9	- 5.5
	90	89.7	- 0.3		83.1	- 7.6		89.1	- 1.0
新乌头碱	2	1.96	- 2.0		1.75	- 12.5		1.92	- 4.0
	20	19.6	- 2.0		17.9	- 10.5		19.3	- 3.5
	90	90.2	0.2		83.9	- 6.8		89.6	- 0.4
滇乌头碱	2	1.89	- 5.5		1.76	- 12.0		1.91	- 4.5
	20	19.8	- 1.0		18.1	- 9.5		19.4	- 3.0
	90	90.3	0.3		83.3	- 7.4		89.4	- 0.7
雪上一枝蒿甲素	2	1.94	- 3.0		1.72	- 14.0		1.89	- 5.5
	20	20.2	1.0		17.7	- 11.5		18.9	- 5.5
	90	89.9	- 0.1		83.6	- 7.1		89.6	- 0.4
雪上一枝蒿乙素	2	1.99	- 0.5		1.77	- 11.5		1.94	- 3.0
	20	19.6	- 2.0		17.9	- 10.5		19.1	- 4.5
	90	90.5	0.6		82.9	- 7.9		89.1	- 1.0

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2.8   方法学应用

采用本法对2019年1月、2020年1月重庆市2起雪上一枝蒿药酒中毒事件中5名患者的全血样品进行检测，血样中均检出滇乌头碱。

3.   结论

本法中全血中雪上一枝蒿中6种生物碱在0.5 ~ 100 ng/mL范围内线性良好，3个加标浓度的提取回收率均大于82%，日内及日间精密度均小于7%，基质效应良好，准确度高。建立的方法灵敏度高、前处理简单，可同时检测雪上一枝蒿中6种生物碱，方便、快速，可以满足低含量的毒物检测需求。