Determination of total arsenic in blood by wet digestion-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry
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摘要:目的 建立血中砷的湿法消解-氢化物发生-原子荧光光谱测定法。方法 血样经3.0 mL混合酸[v（硝酸）∶v（硫酸）：v（高氯酸）=3∶1∶1]于电热板上加热至150℃，保持30 min，升温至200℃，继续保持30 min后升温至270℃消解至冒白烟，液体近干，加入50 g/L硫脲+50 g/L抗坏血酸为预还原剂，以体积分数5%的盐酸为载流，以10.0 g/L硼氢化钾为还原剂，采用氢化物发生-原子荧光光谱法测定血中砷浓度。结果 在0~20.0 μg/L的线性范围内，砷原子荧光光谱强度与血中总砷浓度的线性回归方程为y=70.952 8 x+16.496 2（r=0.999 2，P＜0.01）；检出限为0.24 μg/L，方法的回收率为98.2%~100.4%，精密度为1.7%~2.0%。结论 该方法回收率高、精密度好、消解用酸量少、检测成本低，适合用于基层单位的血中总砷浓度检测。
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砷是一种有毒的类金属元素，接触砷会导致发育缺陷和流产[1]，长期或高剂量接触砷可导致多种后果，包括恶性肿瘤、严重肠胃不适、糖尿病、心律失常、甚至死亡[2-3]。急性砷中毒后常见的临床症状包括吞咽困难、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、口渴和肌肉痉挛，慢性中毒的临床征状包括手掌及脚掌角化过度、色素沉着及结膜炎[4]。砷中毒是一种罕见的疾病，临床特征表现并不明显，诊断必须通过血液、尿液及毛发分析才能确定。正常人全血中砷质量浓度为0.4~12.0 μg/L。急性砷化氢中毒者或者长期暴露于砷环境中的工作者血中总砷浓度明显增高。血中总砷是砷中毒患者诊断的重要参考指标。目前，国内没有检测全血中砷的标准方法。检测全血中砷的检测方法主要有原子吸收法[5-6]、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[7]、湿法消解-氢化物-原子荧光光度法[8]。相对于昂贵的原子吸收光谱仪及电感耦合等离子体质谱仪，原子荧光光度计更易推广使用，适合基层检测。本实验室长期利用湿法消解-氢化物-原子荧光光度法检测职业接触者及急性砷化氢中毒者全血中砷，完善了血中总砷湿法消解-原子荧光法测法，现将该方法报告如下。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
AFS-930双道原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司生产），HAF-2型砷空心阴极灯[国标（北京）检验认证有限公司）]；砷标准应用液：取砷单元素标准溶液，质量浓度1 000 μg/mL（中国计量科学研究院），用体积分数5%的HCl溶液稀释成浓度1.0 μg/mL及100.0 μg/L砷标准应用液。SRM955c血样质控品[（77.5±4.2）μg/L，美国国家技术标准局）]；消解液：v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）=3∶1∶1，均为优级纯，避光保存。预还原剂：50 g/L硫脲+50 g/L抗坏血酸溶液。还原剂：取5.0 g氢氧化钠，用少量超纯水溶解，再加10.0 g硼氢化钾，溶解后用超纯水定容至1 000 mL。载流：体积分数5%的盐酸溶液。实验用水为超纯水。
1.2 全血样采集和保存
用肝素钠真空采血管采集两管疑似重金属过量接触患者的血液，每管4.0 mL，摇匀后置于4 ℃冰箱中保存，尽快测定。
1.3 样品处理
从冰箱中取出血样，恢复至室温，充分摇匀，吸取1.0 mL于三角烧瓶中，加入1.0 mL超纯水，加入两颗小玻璃珠防止暴沸，加3.0 mL消解液，在可控温电热板上加热至150 ℃，保持30 min，升温至200 ℃，继续保持30 min后升温至270 ℃，继续消解至冒白烟，液体近干，取出冷却至室温；加1.0 mL预还原剂，放置30 min后转移到10 mL具塞刻度试管中，用体积分数5%的盐酸溶液定容至10 mL，混匀，上机测定。
1.4 仪器操作条件
检测波长193.7 nm，光电倍增管负高压255 V，灯电流50 mA，辅阴极灯电流25 mA；原子化器温度200 ℃，载气流量400 mL/min，原子化器高度8 mm，屏蔽气流量800 mL/min，读数时间7 s，延时时间1.5 s。测量方式为标准曲线法；采用峰面积进行读数，进样体积1.0 mL。
2. 结果与讨论
2.1 样品前处理对测定结果的影响
2.1.1 消解温度对测定结果的影响
血中总砷湿法消解-原子荧光法测定法目前未形成标准方法。虽然有文献[8]建立了全血砷湿法消解-氢化物-原子荧光光度测定法，对载流和还原剂的浓度进行了考察，但未对样品的消解温度、消解液等前处理进行考察。在日常对血砷的检测中发现，消解温度对结果影响较大，利用消解液[v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）=3∶1∶1]，考察正常人血、加标血样、砷中毒患者血样及山羊血样（批号955c）在电热板上于200、220、240、260、270、280 ℃加热消解的效果，结果见表 1。对比样品荧光值，结果显示：对于正常人血、两份患者血样及山羊血样，随着温度升高，样品荧光值逐渐升高，在260 ℃时升高幅度减缓，大致达到稳定，在270、280 ℃消解的样品响应与260 ℃基本一致。而加标血液样品，在200~280 ℃之间消解检测，随着温度升高荧光值增加，但增加幅度较小。可能是加标样品砷本底值较小，而加入的是无机砷化合物，易于消解，而实际人血样中砷是结合砷，必须高温才能消解完全，本实验选择270 ℃作为消解温度。
表 1 消解温度试验结果消解温度/℃ 样品荧光值 正常人血 患者血样1 患者血样2 加标血样1 加标血样2 山羊血样 200 45.2 564.2 759.2 281.7 1 308.3 642.2 220 53.0 667.5 903.8 279.7 1 290.2 648.0 240 62.7 776.4 1 219.4 295.6 1 333.3 650.1 260 78.7 984.9 1 237.2 310.7 1 457.9 751.4 270 82.7 974.6 1 258.2 310.8 1 423.4 751.9 280 81.2 983.0 1 266.9 303.4 1 441.4 755.1 2.1.2 消解液的选择
分别取1.0 mL加标血样及山羊血质控血样于三角烧瓶中，加入1.0 mL水，分别加入3.0 mL不同混酸消解液进行消解：（1）v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）为3∶1∶1；（2）v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）为5∶3∶1；（3）v（硝酸）∶v（硫酸）为5∶1；（4）v（硝酸）∶v（高氯酸）为4∶1；（5）v（硝酸）∶v（高氯酸）为9∶1。
5种类型的消解液对加标样品及山羊血样品消解测定结果见表 2。试验过程显示v（硝酸）∶v（硫酸）: v（高氯酸）为3∶1∶1的消解效果最好，样品液清澈透亮，消解过程中不需要补加硝酸进行消解；其次是v（硝酸）: v（高氯酸）为4∶1，消解过程也不需要硝酸进行消解，但升高温度，酸挥发过快，高温消解时间短，消解结束不易判断，而其他混合酸需要多次补加硝酸消解，时间更久。故消解液选择v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）为3∶1∶1的混合酸，在270 ℃，消解液中只剩下硫酸，且并未达到硫酸分解温度290 ℃，砷离子可以溶解在硫酸，不易损失。
表 2 消解液试验结果消解液类型 测定值/（μg/L） 加标血样 山羊血样 v（硝酸）∶v（硫酸）= 5∶1 110.35 80.62 v（硝酸）∶v（高氯酸）= 4∶1 102.62 79.25 v（硝酸）∶v（高氯酸）= 9∶1 106.66 80.59 v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）= 3∶1∶1 106.27 80.15 v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）= 5∶3∶1 98.04 77.50 2.2 载流的影响
氢化反应要求有一定的酸度，考察体积分数2%的盐酸、5%的盐酸、2%的硝酸、5%的硝酸、2%的硫酸、5%的硫酸作为载流，检验载流对曲线及样品测定的影响。结果显示：在相同条件下，所有载流所测标准曲线的线性关系良好且灵敏度较高，20.0 μg/L砷标准溶液荧光强度分别为2 030.3、2 186.2、1 982.2、2 000.6、2 113.6及2 083.0，其中体积分数5%的盐酸荧光强度响应最高，为2 186.2。本实验选择体积5%的盐酸为载流。
2.3 标准曲线与检出限
在6个三角烧瓶中，分别加入0、0.10、0.20 mL砷标准溶液（100.0 μg/L），0.05、0.10、0.20 mL砷标准溶液（1.0 μg/mL），各加水至2.0 mL，同1.3样品处理，配制成0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L砷标准系列（样品稀释倍数设定为10），上机测定。以吸光度对砷质量浓度绘制标准曲线。结果表明：砷的质量浓度在0~20.0 μg/L范围内与吸光度值呈线性关系，线性回归方程为y=7 0.952 8 x+16.496 2，相关系数为0.999 2（P＜0.01）。根据GBZ/T 295—2017《职业人群生物监测方法总则》[9]中5.5节方法检出限的要求，制备1个0.30 μg/L的样品，连续测定11次，以样品相应信号的3倍标准差与低剂量的待测物浓度及其响应值计算所得的待测物浓度，所得的浓度即为方法检出限（MDL），本次研究为0.24 μg/L。
2.4 回收率和精密度试验
2.4.1 批内精密度试验
吸取正常人血样1.0 mL置于三角烧瓶中，分别加入1.0 μg/mL的砷标准应用液15、30、100 μL，使其加标浓度分别为15.0、30.0、100.0 μg/L，进行加标回收率试验，每个浓度做6个平行实验，同时做3个血样本底，消解步骤同1.3，结果显示该方法的回收率为98.2%~100.4%，批内精密度RSD为1.7%~2.0%。见表 3。
表 3 批内精密度试验结果加标值/（μg/L） 测定值/（μg/L） 平均值/（μg/L） 回收率/% RSD/% 1 2 3 4 5 6 本底值 5.14 4.59 5.12 4.95 15.0 19.22 20.16 19.95 19.59 19.87 19.25 19.67 98.2 2.0 30.0 35.41 35.04 34.32 35.98 34.66 35.02 35.07 100.4 1.7 100.0 101.31 102.57 105.95 105.73 104.13 101.63 103.55 98.6 1.8 2.4.2 批间精密度试验
取本底值为3.0 μg/L混合血样，分别制备加标值为25.0 μg/L及150.0 μg/L高低两个浓度水平的模拟样品各6份，置于4 ℃冰箱保存，并于第1、3、4、5、6、7天各取1份，按照步骤1.3消解，并上机检测，结果显示批间精密度RSD为2.0%~2.4%。见表 4。
表 4 批间精密度试验结果样品名称 测定值/（μg/L） 平均值/（μg/L） RSD/% 第1天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 样品1 27.84 28.96 27.09 27.29 27.44 27.80 27.74 2.4 样品2 158.00 157.98 152.88 152.08 152.51 149.44 153.82 2.0 2.5 干扰试验
人体通常含有60多种元素，对常量元素离子K+、Na+、Mg2+、Ca2+及微量元素离子Cd2+、Sn2+、Pb2+、Sb2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cr3+等共存离子进行了干扰试验。配制5.0、10.0、20.0 μg/L的砷标准溶液，含有10.0 μg/mL K+、Na+、Mg2+、Ca2+及100.0 μg/L Cd2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cr3+，不干扰测定。100.0 μg/L Sn2+、Sb2+对测定有正干扰，但Sn2+、Sb2+浓度小于20.0 μg/L，荧光值相对偏差小于5%。因Sn2+、Sb2+在血液中含量低，故常见共存离子不干扰血砷测定。
2.6 实际血样的测定
采用本方法对疑似砷过量的病人及砷中毒病人测定全血砷。2019—2020年，本实验室共检测360份样品，血中砷含量大多在1~30 μg/L之间，而砷中毒患者血中砷含量超过100 μg/L，远超正常人血中砷含量。采用本方法对955c山羊血质控血样进行检测，结果在质控范围内。
3. 结论
与之前已发表文献相比，本研究设计的血中砷湿法消解-原子荧光测定法，着重优化了湿法消解的消解温度和消解液，且回收率高、精密度好、消解液用酸量低，仪器价格便宜，容易在基层普及，适合用于职业接触者及急性砷化氢中毒者的全血总砷进行检测。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 消解温度试验结果
消解温度/℃ 样品荧光值 正常人血 患者血样1 患者血样2 加标血样1 加标血样2 山羊血样 200 45.2 564.2 759.2 281.7 1 308.3 642.2 220 53.0 667.5 903.8 279.7 1 290.2 648.0 240 62.7 776.4 1 219.4 295.6 1 333.3 650.1 260 78.7 984.9 1 237.2 310.7 1 457.9 751.4 270 82.7 974.6 1 258.2 310.8 1 423.4 751.9 280 81.2 983.0 1 266.9 303.4 1 441.4 755.1 
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表 2 消解液试验结果
消解液类型 测定值/（μg/L） 加标血样 山羊血样 v（硝酸）∶v（硫酸）= 5∶1 110.35 80.62 v（硝酸）∶v（高氯酸）= 4∶1 102.62 79.25 v（硝酸）∶v（高氯酸）= 9∶1 106.66 80.59 v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）= 3∶1∶1 106.27 80.15 v（硝酸）∶v（硫酸）∶v（高氯酸）= 5∶3∶1 98.04 77.50
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表 3 批内精密度试验结果
加标值/（μg/L） 测定值/（μg/L） 平均值/（μg/L） 回收率/% RSD/% 1 2 3 4 5 6 本底值 5.14 4.59 5.12 4.95 15.0 19.22 20.16 19.95 19.59 19.87 19.25 19.67 98.2 2.0 30.0 35.41 35.04 34.32 35.98 34.66 35.02 35.07 100.4 1.7 100.0 101.31 102.57 105.95 105.73 104.13 101.63 103.55 98.6 1.8
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表 4 批间精密度试验结果
样品名称 测定值/（μg/L） 平均值/（μg/L） RSD/% 第1天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 样品1 27.84 28.96 27.09 27.29 27.44 27.80 27.74 2.4 样品2 158.00 157.98 152.88 152.08 152.51 149.44 153.82 2.0
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[1] PATEL B, DAS R, GAUTAM A, et al. Evaluation of vascular effect of arsenic using in vivo assays[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2017, 24(18): 15521-15527. doi: 10.1007/s11356-017-9156-5
[2] PLATANIAS L C. Biological responses to arsenic compounds[J]. J Biol Chem, 2009, 284(28): 18583-18587. doi: 10.1074/jbc.R900003200
[3] JOMOVA K, JENISOVA Z, FESZTEROVA M, et al. Arsenic: toxicity, oxidative stress and human disease[J]. J Appl Toxicol, 2011, 31(2): 95-107. http://kis.ukf.sk/epcfiles/5BEEF7A0AA8E444290922B14A11E038F/JApplToxicol_2011.pdf
[4] OLSEN V, MØRLAND J. Arsenic poisoning[J]. Tidsskr Nor Laegeforen, 2004, 124(21): 2750-2753. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3051677/
[5] 杨翠英, 霍建勋, 刘平. 原子吸收法同时测定人血中砷硒汞元素[J]. 微量元素与健康研究, 2004, 21(3): 43-45. doi: 10.3969/j.issn.1005-5320.2004.03.021 [6] 张颖花, 高咏, 霍韬光, 等. 利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量[J]. 化学研究, 2013, 24(3): 274-276. doi: 10.3969/j.issn.1008-1011.2013.03.013 [7] 傅艳岚, 雷永良, 宋瑞强, 等. ICP-MS直接测定脐带血中的As、Cd、Pb、Hg[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24(17): 2467-2472. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZWJZ201417013.htm [8] 姜新. 湿法消解-氢化物-原子荧光光度法测定全血砷[J]. 江苏卫生保健, 2008, 10(6): 14-15. doi: 10.3969/j.issn.1008-7338.2008.06.009 [9] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 职业人群生物监测方法总则: GBZ/T 295-2017[S]. 北京: 人民卫生出版社, 2018. -
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1. 艾丽梅，李欣欣，柳安琪，王丹，王敬鑫，胡伟江，万霞. 中国2020年制造业职业性噪声所致听力损失人数估算. 中国职业医学. 2023(05): 512-517 . 
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