Effect of Rad51 gene silencing on repair of lead-induced DNA double-strand breaks in TK6 cells
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+ English摘要:目的 研究Rad51基因沉默后对醋酸铅染毒致人淋巴母细胞（TK6细胞）DNA双链断裂损伤的修复作用的影响。方法 构建Rad51沉默慢病毒载体及阴性对照，感染对数期TK6细胞，荧光定量PCR和Western blot验证感染效果。运用480 μmol/L的醋酸铅染毒TK6细胞24 h（Control组、shRNA-NC组和shRNA-Rad51组），采用免疫荧光法检测TK6细胞的磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）的表达，Western Blot检测TK6细胞的Rad51、BRCA1、53BP1蛋白的表达。结果 shRNA-Rad51组的Rad51 mRNA表达水平和Rad51蛋白表达水平均低于Control组及shRNA-NC组（P＜0.01）；shRNA-Rad51组的γ-H2AX阳性率为（27.48 ± 1.66）%，与Control组的（14.77 ± 1.21）%及shRNA-NC组的（14.04 ± 1.31）%比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；shRNA-Rad51组的BRCA1蛋白表达水平为（0.25 ± 0.03），与Control组的（0.55 ± 0.04）及shRNA-NC组的（0.51 ± 0.04）比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；shRNA-Rad51组的53BP1蛋白表达水平为（3.24 ± 0.27），与Control组的（2.01 ± 0.19）及shRNA-NC组的（2.11 ± 0.17）比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 Rad51基因沉默后，TK6细胞HR修复通路受抑制和NHEJ修复通路激活，TK6细胞对铅遗传毒性的敏感性增强。
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铅是一种自然界广泛存在的有毒重金属，主要通过呼吸道、消化道的途径进入人体，会对人体全身多个系统产生毒性作用，是最常见的环境污染物和职业病危害因素[1]。近年来，铅及其化合物对细胞的遗传损伤广受关注，铅会引起细胞DNA双链断裂损伤，但关于铅对细胞DNA双链断裂损伤后的修复机制的研究有限，且存在争议[2-3]。有研究发现铅遗传毒性的发生与DNA损伤修复基因的表达异常有密切联系，但其具体机制目前还不完全清楚[4]。Rad51基因作为一种DNA修复基因，其编码的蛋白是参与同源重组（homologous recombination，HR）的关键酶，对维持DNA的遗传稳定和多样性起着至关重要的作用[5]。为研究Rad51基因对铅遗传毒性的影响，本研究选取TK6细胞进行传代培养，利用短发夹RNA（shRNA）抑制TK6细胞Rad51基因表达，采用免疫荧光法、荧光定量PCR、Western Blot等分子生物学技术从不同的层面研究Rad51基因沉默后铅致TK6细胞遗传损伤的影响，以期为铅遗传损伤的防控提供实验基础。
1. 材料与方法
1.1 实验试剂和仪器
醋酸铅粉剂（美国Sigma公司）、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）、马血清（美国Gibco公司）、γ-H2AX（英国Abcam公司）、Rad51抗体（中国万类生物公司）、BRCA1抗体（中国万类生物公司）、53BP1抗体（中国abclonal公司）、Super M-MLV反转录酶（北京BioTeke公司）、RNase inhibitor（北京BioTeke公司）、2 × Power Taq PCR MasterMix（北京BioTeke公司）、全蛋白提取试剂盒（中国万类生物公司）、内参抗体β-actin（中国万类生物公司）、羊抗兔IgG-HRP（中国万类生物公司）；NW10LVF超纯水系统（香港Heal Force公司）、H-2050R超速冷冻离心机（湖南湘仪公司）、DYCZ-24DN双垂直蛋白电泳仪（北京六一公司）、Exicycler 96荧光定量PCR仪（韩国BIONEER公司）、NANO 2000紫外分光光度计（美国Thermo公司）、WD-9413B型凝胶成像系统（北京六一公司）、ELX-800酶标仪（美国BIOTEK公司）。
1.2 方法
1.2.1 Rad51 shRNA干扰慢病毒载体构建
Rad51 shRNA干扰慢病毒载体（pLKO.1-EGFP-puro）由万类生物科技有限公司构建。干扰序列sh-Rad51：ccgCGATGTGAAGAAATTGGAAGAttcaagagaTCTTCCAATTTCTTCACATCGttttt，对照序列sh-NC：ccgTTCTCCGAACGTGTCACGTttcaagagaACGTGACACGTTCGGAGAAttttt。
1.2.2 细胞培养和实验分组
TK6细胞由福建省疾病预防控制中心郑奎成教授提供。TK6细胞培养条件为37 ℃下添加10%热灭活马血清的RPMI1640培养基，置于体积分数5%的二氧化碳培养箱中。TK6细胞分4组：Normal组（未经感染的TK6细胞，醋酸铅未染毒）、Control组（未经感染的TK6细胞，480 μmol/L的醋酸铅避光染毒24 h）、shRNA-NC组（经空载慢病毒感染的TK6细胞，480 μmol/L的醋酸铅避光染毒24 h）、shRNA-Rad51组（经干扰慢病毒感染的TK6细胞，480 μmol/L的醋酸铅避光染毒24 h）。
1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）
提取样本总RNA，使用紫外分光光度计NANO 2000测定各样本中RNA的浓度。将得到的RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA（引物序列见表 1），用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪通过2-△△CT方法进行荧光定量分析，反应条件为94 ℃ 5 min，1个循环；94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。
表 1 Rad51基因qPCR的引物序列名称 序列（5′-3′） 引物长度/bp 解链温度（tm）/℃ 产物长度/bp Rad51 F AAATGCCAACGATGTGA 17 49.4 220 Rad51 R GGAGCCAGTAGTAATCTGTATG 22 51.5 β-actin F GGCACCCAGCACAATGAA 18 57.7 168 β-actin R TAGAAGCATTTGCGGTGG 18 55.1 1.2.4 Western blot检测
抽提样本蛋白质，使用酶标仪测定各样本中蛋白质的浓度。依次进行SDS-PAGE、转印至PVDF膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ECL底物发光、图像保存、用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。
1.2.5 免疫荧光染色检测γ-H2AX表达
收集细胞并固定在载玻片上，将载玻片与体积分数0.1% tritonX-100在室温下孵育30 min。用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，并在室温下与山羊血清孵育15 min。此后，添加多克隆抗H2AX抗体4 ℃过夜孵育。然后，用PBS清洗，并在室温下与Cy3标记山羊抗兔IgG孵育1 h。用PBS清洗，使用荧光染料DAPI进行核复染。用PBS清洗，将细胞均匀地涂在干净的载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下放大400倍观察染色效果。
1.2.6 统计学分析
采用SPSS 19.0软件进行统计分析，连续性数据的描述采用均数±标准差（x ± s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α = 0.05。
2. 结果
2.1 Rad51基因沉默对TK6细胞Rad51基因表达的影响
应用荧光定量PCR和Western Blot技术检测Rad51基因沉默后TK6细胞的mRNA和蛋白的表达水平。荧光定量PCR扩增体系稳定，熔解曲线峰值高，无引物二聚体及非特异性产物产生，扩增产物特异（见图 1）。各组间mRNA、Rad51蛋白表达水平差异均有统计学意义（P＜0.01）。进一步两两比较，与Control组和shRNA-NC组相比，shRNA-Rad51组细胞中Rad51蛋白mRNA表达量均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），而Control组和shRNA-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
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图 1 荧光定量PCR熔解曲线和扩增曲线注：熔解曲线的横坐标为温度/℃, 扩增曲线横坐标为循环数（无单位）；纵坐标为荧光强度（无单位，相对定量，数值为PCR反应仪器识别的信号强度）。表 2 K6细胞Rad51基因的表达（n = 3）组别 mRNA表达水平 Rad51蛋白表达水平 Control组 1.00 ± 0.02 1.00 ± 0.08 shRNA-NC组 0.99 ± 0.06 0.96 ± 0.06 shRNA-Rad51组 0.24 ± 0.01 0.20 ± 0.03 F值 259.84 167.78 P值 ＜0.01 ＜0.01 Western Blot结果显示，相比于Control组和shRNA-NC组，shRNA-Rad51组中Rad51蛋白的表达量呈现明显下降趋势，下降约80%，差异具有统计学意义（P＜0.01），而Control组和shRNA-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2、表 2。
2.2 Rad51基因沉默对TK6细胞DNA双链断裂损伤生物标志物γ-H2AX表达的影响
γ-H2AX蛋白是反映DNA双链断裂损伤的生物标志物。采用免疫荧光技术观察Rad51基因沉默后醋酸铅诱导细胞DNA双链断裂的情况，如图 3所示，DAPI荧光染色的细胞核呈现蓝色，而Cy3荧光标记的γ-H2AX蛋白呈现红色。Normal组、Control组、shRNA-NC组、shRNA-Rad51组γ-H2AX阳性率分别为（1.81 ± 0.58）%、（14.77 ± 1.21）%、（14.04 ± 1.31）%、（27.48 ± 1.66）%，4组比较差异有统计学意义（F = 210.32，P＜0.01）；进一步比较显示，shRNA-Rad51组γ-H2AX阳性率高于Control组和shRNA-NC组，差异均有统计学意义（P＞0.01），而Control组细胞γ-H2AX阳性率和shRNA-NC组细胞γ-H2AX阳性率差异无统计学意义（P＜0.05）。见图 3、表 3。
表 3 TK6细胞γ-H2AX阳性率和BRCA1、53BP1蛋白表达的影响（n = 3） 组别 细胞γ-H2AX阳性率/% BRCA1蛋白表达水平 53BP1蛋白表达水平 Normal组 1.81 ± 0.58① 1.00 ± 0.06① 1.00 ± 0.11① Control组 14.77 ± 1.21① 0.55 ± 0.04① 2.01 ± 0.19① shRNA-NC组 14.04 ± 1.31① 0.51 ± 0.04① 2.11 ± 0.17① shRNA-Rad51组 27.48 ± 1.66 0.25 ± 0.03 3.24 ± 0.27 F值 210.32 151.21 67.13 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 注：①与shRNA-Rad51组比较，P＜0.01。 2.3 Rad51基因沉默对DNA双链断裂损伤修复蛋白BRCA1表达的影响
醋酸铅染毒24 h后，Normal组、Control组、shRNA-NC组、shRNA-Rad51组的BRCA1蛋白表达水平分别为（1.00 ± 0.06）、（0.55 ± 0.04）、（0.51 ± 0.04）、（0.25 ± 0.03），4组比较差异具有统计学意义（F = 151.21，P＜0.01）；进一步比较显示，shRNA-Rad51组BRCA1蛋白表达水平低于Control组和shRNA-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.01），而Control组细胞BRCA1蛋白表达水平和shRNA-NC组细胞BRCA1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 4、表 3。
2.4 Rad51基因沉默对DNA双链断裂损伤修复蛋白53BP1表达的影响
醋酸铅染毒24 h后，Normal组、Control组、shRNA-NC组、shRNA-Rad51组的53BP1蛋白表达水平分别为（1.00 ± 0.11）、（2.01 ± 0.19）、（2.11 ± 0.17）、（3.24 ± 0.27），4组比较差异具有统计学意义（F = 67.13，P＜0.01）；进一步比较显示，shRNA-Rad51组53BP1蛋白表达水平高于Control组和shRNA-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.01），而Control组细胞53BP1蛋白表达水平和shRNA-NC组细胞53BP1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 4、表 3。
3. 讨论
真核细胞DNA双链断裂主要通过同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）两种方式进行修复，若修复机制产生缺陷将导致遗传物质改变[6]。Rad51蛋白是HR修复通路中的一个生物活性标志物，是调控HR修复DNA双链断裂的核心蛋白，是催化断裂的DNA双链与完整的同源DNA姐妹链进行链间转移置换的关键酶，Rad51蛋白所介导的同源重组修复有利于维持基因组的稳定，抵抗各种细胞毒性因子对DNA的损害，在HR修复通路中扮演主要角色[5, 7]。
TK6细胞为人源细胞，分化能力高，拥有稳定的基因组，与常用的小鼠细胞相比，p53基因表达正常，可以更加真实地反映毒物对人体细胞的毒性作用，可避免动物实验结果外推至人的种属差异等。本研究应用Rad51 shRNA干扰慢病毒载体（pLKO.1-EGFP-puro）感染TK6细胞，应用实时荧光定量PCR和Western Blot技术检测Control组、shRNA-NC组和shRNA-Rad51组中Rad51基因mRNA和蛋白的表达水平，显示shRNA-Rad51组的mRNA和蛋白的表达明显下降，说明Rad51 shRNA能够有效抑制TK6细胞Rad51的表达。γ-H2AX是DNA双链断裂的标志物，本研究使用免疫荧光法检测3组TK6细胞在醋酸铅染毒后细胞γ-H2AX焦点形成情况，发现铅诱导shRNA-Rad51组TK6细胞γ-H2AX的表达显著增高，研究结果提示，Rad51表达下调会明显降低TK6细胞维持基因完整性的能力。Rad51在HR中扮演着不可缺少的角色，Rad51表达的下调与细胞执行HR能力的下降存在着极大的关联[5]。近年来，有实验用siRNA抑制Rad51基因表达后，发现细胞对DNA损伤更敏感[8]，这与本研究的结果相似。
DNA双链断裂是最严重的细胞遗传损伤，细胞发生遗传损伤后会引发DNA损伤修复。细胞DNA双链断裂损伤的修复机制主要有HR修复和NHEJ修复两种。BRCA1蛋白是调控HR修复DNA双链断裂的关键蛋白，在HR修复通路的多个环节发挥作用，53BP1蛋白是参与DNA双链断裂后NHEJ修复通路的重要蛋白[9]。本研究中检测了BRCA1与53BP1蛋白的表达，醋酸铅作用TK6细胞后24 h，shRNA-Rad51组TK6细胞BRCA1的表达出现了显著降低，53BP1的表达出现显著升高，提示Rad51基因沉默可能导致TK6细胞HR修复通路的抑制和NHEJ修复通路的激活，促进TK6细胞的NHEJ修复效率。
HR修复和NHEJ修复两种修复通路共同维持基因组的完整性，但也存在着竞争抑制，HR通路的抑制和/或NHEJ通路的激活将使DNA双链断裂倾向于易错修复途径，导致染色体异常等遗传损伤生成[10-12]。本研究显示，Rad51基因沉默后，TK6细胞容易被铅诱导DNA双链断裂，其机制可能存在HR修复通路抑制和NHEJ修复通路异常活化，修复过程有NHEJ的倾向性。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
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图 1 荧光定量PCR熔解曲线和扩增曲线
注：熔解曲线的横坐标为温度/℃, 扩增曲线横坐标为循环数（无单位）；纵坐标为荧光强度（无单位，相对定量，数值为PCR反应仪器识别的信号强度）。
表 1 Rad51基因qPCR的引物序列
名称 序列（5′-3′） 引物长度/bp 解链温度（tm）/℃ 产物长度/bp Rad51 F AAATGCCAACGATGTGA 17 49.4 220 Rad51 R GGAGCCAGTAGTAATCTGTATG 22 51.5 β-actin F GGCACCCAGCACAATGAA 18 57.7 168 β-actin R TAGAAGCATTTGCGGTGG 18 55.1 
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表 2 K6细胞Rad51基因的表达（n = 3）
组别 mRNA表达水平 Rad51蛋白表达水平 Control组 1.00 ± 0.02 1.00 ± 0.08 shRNA-NC组 0.99 ± 0.06 0.96 ± 0.06 shRNA-Rad51组 0.24 ± 0.01 0.20 ± 0.03 F值 259.84 167.78 P值 ＜0.01 ＜0.01
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表 3 TK6细胞γ-H2AX阳性率和BRCA1、53BP1蛋白表达的影响
（n = 3） 组别 细胞γ-H2AX阳性率/% BRCA1蛋白表达水平 53BP1蛋白表达水平 Normal组 1.81 ± 0.58① 1.00 ± 0.06① 1.00 ± 0.11① Control组 14.77 ± 1.21① 0.55 ± 0.04① 2.01 ± 0.19① shRNA-NC组 14.04 ± 1.31① 0.51 ± 0.04① 2.11 ± 0.17① shRNA-Rad51组 27.48 ± 1.66 0.25 ± 0.03 3.24 ± 0.27 F值 210.32 151.21 67.13 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 注：①与shRNA-Rad51组比较，P＜0.01。
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