Investigation on sperm concentration of workers occupationally exposed to pyrethroids
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+ English摘要:目的 调查拟除虫菊酯暴露与工人体内氧化应激状态和精子浓度的关联性，为制定拟除虫菊酯职业暴露引起男性职业性生殖毒性损害的诊断标准提供依据。方法 2020年9-10月，选取武汉市某拟除虫菊酯类农药工厂一线岗位234名成年男性工人为暴露组，117名成年男性行政后勤人员为对照组，收集调查对象的一般人口学信息并采集尿液5mL，检测尿中3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)、8-羟氧基苯甲酸(8-OHdG)浓度；采集调查对象禁欲3d后的精液，测量精子浓度。同时检测该工厂生产工人主要接触的化学有害因素浓度。结果 生产工人主要接触的化学有害因素为: 溴氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯和顺式氯氰菊酯。暴露组人员的3-PBA浓度、8-OHdG浓度均高于对照组，精子浓度低于对照组，差异均有统计学意义(P < 0.01)。经Person相关性检验，351名研究对象3-PBA浓度与8-OHdG浓度呈正相关(r=0.511，P < 0.01)，与精子浓度呈负相关(r=-0.546，P < 0.01)；8-OHdG浓度(经自然对数转换)与精子浓度呈负相关(r=-0.113，P < 0.05)。线性回归模型分析结果显示: (1)尿中3-PBA浓度(经自然对数转换)每增加1μg/g，8-OHdG浓度增加7.362μg/g，精子浓度减少0.136×108个/mL；(2)BMI每增加1kg/m2，8-OHdG浓度增加0.396μg/g，精子浓度减少0.014×108个/mL。未观察到年龄、吸烟、饮酒与8-OHdG浓度、精子浓度之间的剂量-效应关系。结论 拟除虫菊酯暴露可能会升高男性职业接触人群氧化应激水平，降低精子浓度，应加强工人的职业防护。
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关键词:
- 拟除虫菊酯 /
- 3-苯氧基苯甲酸(3-PBA) /
- 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG) /
- 精子浓度 /
- 氧化应激
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近年来全球范围内男性精子浓度呈现下降趋势[1-2]，有研究[3]显示我国男性精子浓度在2001—2015年间累计下降50%。对其原因的解释尽管有多种，但其确切发病机制仍不是很清楚。有理论认为人们日常接触的化学用品如拟除虫菊酯可以通过影响性激素水平，进而影响精子浓度，然而该理论无法解释性激素水平正常的男性其精子浓度显著下降的现象。日本曾有一项研究[4]报道男性不育患者精液中氧化应激水平过高，并有显著的精子DNA损伤。目前还未有从氧化应激的角度报道拟除虫菊酯与男性精子浓度下降之关联性的研究。我们前期调查发现，尽管有防护措施，但职业接触工人的拟除虫菊酯暴露水平依旧高于普通人群。项目组拟以某拟除虫菊酯类农药工厂的男性生产工人和同厂行政后勤人员为研究对象，调查拟除虫菊酯暴露水平与工人体内氧化应激状态和精子浓度的关联性。
1. 对象与方法
1.1 对象
2020年9—10月，以武汉市某拟除虫菊酯类农药工厂生产一线岗位的全部成年男性工人为暴露组；按照人员数量2∶1的比例，选择同一工厂年龄相差不超过± 3岁的成年男性行政后勤人员为对照组，进行本次研究。排除标准：（1）先天性输精管缺如不育者；（2）尿样不全者；（3）问卷信息不完整者；（4）入职时间不足3个月者。最终纳入暴露组234人，对照组117人。本次研究已经获得珠海市慢性病防治中心伦理委员会（现改名为珠海市第三人民医院伦理委员会）的批准，所有参与研究者均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 问卷调查
由经过统一培训的调查员在公司集中体检时通过面对面的形式，要求调查对象填写纸质调查问卷。调查研究对象的个人人口学资料（姓名、年龄、民族）、职业接触史（工种和相应工龄）、吸烟和烟酒史以及个人和家族既往病史、生育史等健康相关信息。吸烟判定标准：目前每周吸烟大于1支，且连续吸烟半年以上者归为吸烟；饮酒判定标准：目前每月饮酒大于1次，不限定饮酒量，且连续饮酒半年以上者归为饮酒。
1.2.2 尿中拟除虫菊酯代谢产物浓度测定
（1）3-苯氧基苯甲酸（3-Phenoxybenzoic acid，3-PBA）是拟除虫菊酯在人体内最主要的代谢产物，尿中3-PBA是一种相对经济可行、能相对准确和客观地代表拟除虫菊酯在人体内暴露水平的生物标志[5]。由经过统一培训的采样员在上午一次性采集研究对象中段尿50 mL于无菌无酶聚丙烯离心管中，并立即保存于-20 ℃冰箱中直至实验室测定。采样结束后，每份尿样分装于5 mL小管后利用气相色谱-质谱仪检测3-PBA浓度[5]。本文所得浓度经过肌酐校正。
（2）8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2 deoxyguanos ine，8-OHdG）是反映体内氧化应激水平最常见的一种指标[9]。采集尿样后，利用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定尿中8-OHdG浓度。本文所得浓度经过肌酐校正。
1.2.3 精液采集和浓度测定
禁欲3 d后，所有研究对象采取手淫法留精于10 mL无菌无酶聚丙烯离心管中，液化后取5 μL精液，利用计算机辅助精液分析系统（computer-aided sperm analysis，CASA）测量精子浓度。
1.2.4 统计学分析
所有问卷资料均由经过统一培训的录入人员双份平行录入至EpiData软件中，然后导入SPSS 16.0统计学软件中建库。采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验进行连续性计量资料的正态性检验，不符合正态分布的进行自然对数转换；符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示，两组间差异比较采用独立样本t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；用线性回归模型检验8-OHdG浓度和精子浓度的影响因素。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 基本情况
该拟除虫菊酯类农药工厂生产工人主要接触的化学有害因素为：（1）溴氰菊酯，其定期检测报告显示环境中时间加权平均浓度（CTWA）为0.04 mg/m3；（2）氯氰菊酯，其定期检测报告显示环境中CTWA为0.04 mg/m3；（3）高效氯氰菊酯和顺式氯氰菊酯，两者定期检测报告显示环境中CTWA均低于检出限。
接触途径以呼吸和皮肤吸收为主，个人防护主要佩戴活性炭口罩和防护手套。暴露组不接触其他化学有害因素。对照组人员是以研发、销售、办公等为主的行政后勤人员，极少接触职业病危害因素。
234名暴露组人员年龄22.8 ~ 32.2岁，平均（28.03 ± 2.23）岁；平均工龄（5.13 ± 2.89）年；平均体质量指数（body mass index，BMI）（24.08 ± 3.11）kg/m2；饮酒65人，占比27.8%；吸烟112人，占比47.9%。
117名对照组人员年龄21.9 ~ 31.8岁，平均（27.77 ± 2.23）岁；平均工龄（5.12 ± 4.88）年；平均BMI（21.95 ± 2.67）kg/m2；饮酒25人，占比21.4%；吸烟43人，占比36.8%。
两组人员年龄、工龄比较，差异无统计学意义（t = - 1.047、- 0.023，P > 0.05）；两组饮酒人员占比差异亦无统计学意义（χ2 = 1.629，P > 0.05）。两组人员BMI均值、吸烟人员占比差异均有统计学意义（t = - 6.669、χ2 = 3.905，P < 0.05）。
2.2 两组人群3-PBA、8-OHdG、精子浓度比较
暴露组人员3-PBA浓度为（1.89 ± 1.18）μg/g（以肌酐校正），高于对照组的（0.68 ± 0.17）μg/g（以肌酐校正），因两组人员3-PBA浓度不符合正态分布，经自然对数转换后符合正态分布，故取其自然对数转换值见表 1。
表 1 研究对象3-PBA、8-OHdG和精子浓度组别 例数 3-PBA浓度对数转换值/（μg/g） 8-OHdG浓度/（μg/g） 精子浓度/（×108个/mL） 对照组 117 - 0.42 ± 0.28 46.39 ± 7.77 0.88 ± 0.15 暴露组 234 0.52 ± 0.44 54.78 ± 9.64 0.73 ± 0.16 t值 - 24.285 - 8.174 8.140 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 数值转换后，暴露组人员的3-PBA浓度、8-OHdG浓度均高于对照组，精子浓度低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.01）。见表 1。
2.3 3-PBA、8-OHdG、精子浓度的相关性分析
表 1的结果提示职业接触拟除虫菊酯可能对8-OHdG浓度和精子浓度产生影响，因此本文进一步进行三者关系的相关性分析。经Person相关性检验，351名研究对象的3-PBA浓度（自然对数转换值）与8-OHdG浓度呈正相关（r = 0.511，P < 0.01），与精子浓度呈负相关（r = - 0.546，P < 0.01）；8-OHdG浓度与精子浓度呈负相关（r = - 0.113，P < 0.05）。
2.4 不同研究对象8-OHdG、精子浓度比较
351名研究对象中，年龄 > 30岁组、吸烟者、BMI ≥ 24 kg/m2者的8-OHdG浓度分别高于≤ 30岁组、不吸烟者、BMI < 24 kg/m2者，差异有统计学意义（P < 0.05）；年龄≤ 30岁组、BMI < 24 kg/m2者精子浓度分别高于年龄 > 30岁组、BMI ≥ 24 kg/m2者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 2。
表 2 不同研究对象8-OHdG、精子浓度比较变量 例数 8-OHdG浓度/（μg/g） t值 P值 精子浓度/（× 108个/mL） t值 P值 年龄/岁 - 1.969 0.049 2.077 0.039 ≤ 30 283 51.48 ± 10.12 0.79 ± 0.17 > 30 68 54.09 ± 8.53 0.74 ± 0.18 吸烟 - 2.183 0.030 0.294 0.769 否 196 50.96 ± 9.60 0.78 ± 0.15 是 155 53.27 ± 10.09 0.78 ± 0.19 饮酒 - 0.158 0.874 - 0.739 0.460 否 259 51.93 ± 9.88 0.78 ± 0.17 是 92 52.12 ± 9.90 0.79 ± 0.18 BMI/（kg/m2） - 5.146 < 0.001 7.244 < 0.001 < 24 110 49.80 ± 8.79 0.83 ± 0.16 ≥ 24 241 55.12 ± 10.52 0.71 ± 0.16 2.5 3-PBA浓度与8-OHdG、精子浓度的剂量-效应关系
分别以8-OHdG浓度、精子浓度为响应变量，以3-PBA浓度（经自然对数转换）和表 2中导致结果差异有统计学意义（P < 0.05）的变量为预测变量，纳入线性回归模型，进行多因素分析。结果显示：（1）尿中3-PBA浓度（经自然对数转换）每增加1 μg/g，8-OHdG浓度增加7.362 μg/g，精子浓度减少0.136 × 108个/mL；（2）BMI每增加1 kg/m2，8-OHdG浓度增加0.396 μg/g，精子浓度减少0.014 ×108个/mL。未观察到年龄、吸烟、饮酒与8-OHdG浓度、精子浓度之间的剂量-效应关系。见表 3。
表 3 暴露组3-PBA与8-OHdG、精子浓度的剂量-效应关系响应变量 预测变量 偏回归系数 标准误 t值 P值 8-OHdG浓度/（μg/g） 3-PBA浓度/（μg/g） 7.362 0.816 9.019 < 0.001 年龄/岁 0.380 0.203 1.878 0.061 吸烟（对照：不吸烟） 3.463 1.891 1.831 0.068 饮酒（对照：不饮酒） 3.422 1.502 2.502 0.073 BMI/（kg/m2） 0.396 0.153 2.583 0.010 精子浓度/（×108个/mL） 3-PBA浓度/（μg/g） - 0.136 0.013 - 10.120 < 0.001 年龄/岁 0.000 0.003 0.056 0.955 吸烟（对照：不吸烟） 0.029 0.031 0.926 0.355 饮酒（对照：不饮酒） - 0.003 0.022 - 0.149 0.881 BMI/（kg/m2） - 0.014 - 0.003 - 5.611 < 0.001 3. 讨论
本次调查一共纳入了351名研究对象，调查发现暴露组和对照组尿中3-PBA的检出率均为100%，高于郑明岚等[6]的研究对象尿中3-PBA的检出率（84.2%）；对照组3-PBA浓度为（0.68 ± 0.17）μg/g（以肌酐校正），与张雄等[7]报道的孕期尿液介于0.413 ~ 0.459 μg/g接近，略高于蹇秀桂等[8]报道的女性尿液3-PBA浓度（0.39 μg/g）。这可能跟本次研究对象均是职业人群且都是成年男性有关。
本次研究结果发现：暴露组3-PBA和8-OHdG浓度高于对照组，精子浓度低于对照组（P < 0.05）。该结果提示拟除虫菊酯暴露与人体尿中3-PBA和8-OHdG的浓度升高和精子浓度的下降可能存在事实上的统计学关联。拟除虫菊酯类农药是一种人工合成的高效、低毒和广谱农药，在农、林业生产中用途广泛，在居家生活中因为灭蚊需要一般人群也有较多的接触机会。既往动物实验研究[9]发现：拟除虫菊醋类农药能够影响睾酮（testosterone，T）、促卵泡生成激素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）等生殖激素水平，造成雄性性腺轴内分泌紊乱。此外也有研究发现拟除虫菊酯可以升高雄性生殖细胞的氧化应激。本次研究结果与上述动物实验的结论有着一定的相似性。
相关分析结果显示3-PBA浓度与8-OHdG浓度呈正相关，这与张红丹等[10]在男性体检人群中发现另一种常见杀虫剂有机磷酸酯代谢产物尿中磷酸二乙酯（diethyl phosphate，DEP）、磷酸二正丁酯（dibutyl phosphate，DnBP）、磷酸二苯酯（diphenyl phosphate，DPhP）、双（2-氯乙基）磷酸酯[bis（2-chloroethyl）phosphate，BCEP]、双（1，3-二氯-2-丙基）磷酸酯[bis（1，3-dichloro-2-propyl）phosphate，BDCPP]呈正相关（r = 0.240 ~ 0.448，P < 0.05）的结果相似。
相关性分析还发现3-PBA浓度与精子浓度呈负相关，进一步的线性回归分析也显示拟除虫菊酯的重要代谢产物3-PBA与8-OHdG浓度增加和精子浓度下降呈剂量-效应关系（P < 0.05）。这可能跟拟除虫菊酯作为一种环境内分泌干扰物能够影响性激素（LH、FSH）有关[11]，性激素水平的改变进而影响下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱进而引起睾丸间质细胞和生精细胞凋亡增多[12]，最终引起精子浓度的降低；既往研究[13]发现降低氧化应激水平有助于降低精子细胞DNA损伤。
线性回归分析结果还显示随着BMI的增加，尿中8-OHdG浓度也增加，精子浓度减少（P < 0.05）。拟除虫菊酯属于有机物，根据相似相容原理，本类农药多不溶于水或难溶于水，但可溶于多种有机溶剂。体内脂肪分布可能对拟除虫菊酯在体内的蓄积产生相应影响。本研究结果也提示BMI和精子浓度存在关联，既BMI越高的人其精子浓度可能越低。
一般来说吸烟和饮酒与拟除虫菊酯暴露水平无直接关系，但可能会对氧化应激水平和精子浓度造成影响[14-17]。但本次研究没有发现两者对精子数量有影响，可能是因为：本次研究未对吸烟支数和平均饮酒量进行定量调查，且样本量不够充足。本次暴露人群年龄范围在22.8 ~ 32.2岁之间，而年龄对精子浓度的影响可能是要以10年计或20年计的维度来衡量，因而也未观察到年龄对精子数量的影响。
综上所述，拟除虫菊酯暴露可能会升高男性职业接触人群氧化应激水平，降低精子浓度，且呈一定的剂量-效应关系。目前关于拟除虫菊酯职业暴露和男性生殖健康的研究报道非常有限，其对人体氧化应激影响的机制仍然不明确，需要进一步的研究加以证实。今后有待更佳的方法设计（如随访研究和精确的个体采样）和更大样本量的研究，对本次研究所得结果做进一步的证实。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 研究对象3-PBA、8-OHdG和精子浓度
组别 例数 3-PBA浓度对数转换值/（μg/g） 8-OHdG浓度/（μg/g） 精子浓度/（×108个/mL） 对照组 117 - 0.42 ± 0.28 46.39 ± 7.77 0.88 ± 0.15 暴露组 234 0.52 ± 0.44 54.78 ± 9.64 0.73 ± 0.16 t值 - 24.285 - 8.174 8.140 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 
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表 2 不同研究对象8-OHdG、精子浓度比较
变量 例数 8-OHdG浓度/（μg/g） t值 P值 精子浓度/（× 108个/mL） t值 P值 年龄/岁 - 1.969 0.049 2.077 0.039 ≤ 30 283 51.48 ± 10.12 0.79 ± 0.17 > 30 68 54.09 ± 8.53 0.74 ± 0.18 吸烟 - 2.183 0.030 0.294 0.769 否 196 50.96 ± 9.60 0.78 ± 0.15 是 155 53.27 ± 10.09 0.78 ± 0.19 饮酒 - 0.158 0.874 - 0.739 0.460 否 259 51.93 ± 9.88 0.78 ± 0.17 是 92 52.12 ± 9.90 0.79 ± 0.18 BMI/（kg/m2） - 5.146 < 0.001 7.244 < 0.001 < 24 110 49.80 ± 8.79 0.83 ± 0.16 ≥ 24 241 55.12 ± 10.52 0.71 ± 0.16
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表 3 暴露组3-PBA与8-OHdG、精子浓度的剂量-效应关系
响应变量 预测变量 偏回归系数 标准误 t值 P值 8-OHdG浓度/（μg/g） 3-PBA浓度/（μg/g） 7.362 0.816 9.019 < 0.001 年龄/岁 0.380 0.203 1.878 0.061 吸烟（对照：不吸烟） 3.463 1.891 1.831 0.068 饮酒（对照：不饮酒） 3.422 1.502 2.502 0.073 BMI/（kg/m2） 0.396 0.153 2.583 0.010 精子浓度/（×108个/mL） 3-PBA浓度/（μg/g） - 0.136 0.013 - 10.120 < 0.001 年龄/岁 0.000 0.003 0.056 0.955 吸烟（对照：不吸烟） 0.029 0.031 0.926 0.355 饮酒（对照：不饮酒） - 0.003 0.022 - 0.149 0.881 BMI/（kg/m2） - 0.014 - 0.003 - 5.611 < 0.001
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