Analysis of 189 cases of pneumoconiosis complicated with tuberculosis
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+ English摘要:目的 研究尘肺病患者合并肺结核的感染现状，降低尘肺病病人结核病的发生率。方法 收集2020-2021年在湖南省职业病防治院住院治疗的尘肺病合并肺结核的189例病例进行调查。结果 尘肺病合并肺结核的合并率为2.43%(189/7 785)。尘肺病合并肺结核的病种包括煤工尘肺、矽肺、混合尘肺、水泥尘肺共4种，以煤工尘肺和矽肺为主，分别占56.6%和40.7%。合并肺结核的发病年龄为(58.31±9.08)岁，煤工尘肺合并肺结核病例的发病年龄高于矽肺合并肺结核病例(P < 0.05)。尘肺病合并肺结核的病例中，壹期、贰期、叁期的合并率依次为1.00%、1.89%、3.56%，随着期别增加而上升(P < 0.05)。煤工尘肺合并肺结核病例利福平耐药率为10.28%(11/107)，矽肺则为11.68%(9/77)，其余尘肺病患者利福平耐药率为0，三者差异无统计学意义(P>0.05)。结论 尘肺病合并肺结核以煤工尘肺和矽肺最常见，对合并率影响最主要的因素是尘肺病期别。各种尘肺病合并肺结核病例对利福平的耐药率接近。
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百草枯（paraquat，PQ）是一种非选择性触杀除草剂，由于除草效率高，接触土壤后又可钝化失活，不会伤害植物根系，也不会造成环境污染，使得PQ曾在全球120多个国家和地区广泛使用。然而，随着PQ使用量的增加，也出现了大量PQ中毒事故[1]，2008—2011年间，国家中毒控制中心中毒咨询热线确认的PQ中毒病例达824例，其中大多数为口服PQ中毒，病死率高达31.0% ~ 97.0% [2]。为此我国自2014年7月1日起，撤销了PQ水剂登记和生产许可，停止其生产[3]。但目前仍有大量库存在市场流通和使用，甚至有不法商贩将PQ冠以“敌草快”“草铵膦”等低毒除草剂出售和使用，造成的中毒事件仍层出不穷[4-5]。本研究建立了家兔经口染毒PQ的实验动物模型，并研究PQ在兔体内的毒物代谢动力学（toxicokinetics，TK）过程，以期为PQ中毒的诊断和治疗提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
14只普通级新西兰白色家兔购自广东省医学实验动物中心，雌雄各半，体质量（2.22 ± 0.20）kg，实验动物合格证号：SCXK（粤）2019-0035。饲养于深圳市疾病预防控制中心动物房。按照GB 14925—2010《实验动物环境及设施》 [6]的条件进行常规饲养，动物自由采食和饮水。本研究通过深圳市职业病防治院伦理委员会伦理审查。
1.1.2 仪器和试剂
Shimadzu LC-20ADXR高效液相色谱仪（日本岛津公司）、API 4000+三重四级杆串联质谱仪（美国AB Sciex公司）、SIGMA 3K15高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）、MS3型漩涡混合器（德国IKA公司）；XBridge BEH-HILIC色谱柱（美国Waters公司）、PQ水剂（质量分数20%）（江苏南通先正达公司）、PQ标准品（上海安谱公司）、PQ-d8标准品（北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、甲酸铵（均为色谱纯，中国CNW公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与染毒
家兔在动物房适应性喂养7 d后，按照随机数字表法分为低剂量染毒组（6只）和高剂量染毒组（8只）2组。家兔染毒前24 h禁食，染毒前12 h禁水。实验前将家兔固定于家兔固定架上，以婴儿导尿管为胃管，经开口器中间孔插入约25 ~ 30 cm，进入胃内后再次用10 mL注射器进行抽吸，确认插入位置正确后进行灌胃染毒操作。低剂量染毒组：以每千克体重2 mL体积的50 mg/mL PQ水溶液灌胃，即染毒剂量为100 mg/kg，一次性灌胃染毒。高剂量染毒组：以每千克体重2 mL体积的100 mg/mL PQ水溶液灌胃，即染毒剂量为200 mg/kg，一次性灌胃染毒。染毒后4 h恢复饮水，8 h恢复进食。
1.2.2 样品采集
两组家兔分别在染毒前（0 min）和染毒后10 min、20 min、40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、24 h、72 h和7 d经耳中央动脉采集血液0.5 ~ 1.0 mL，置于肝素抗凝管中，然后立即在4 ℃低温，4 000 r/min（离心半径16.9 cm）离心出血浆用于PQ检测。
1.2.3 血浆中PQ检测
（1）样品前处理。取200 μL血浆样品于1.5 mL塑料离心管中，加入800 μL乙腈甲酸水溶液（乙腈∶体积分数0.1%的甲酸水溶液= 3 ∶ 1），加入40 μL 1.0 mg/L PQ-d8内标液，涡旋振荡5 min，12 000 r/min（离心半径8.26 cm）离心5 min，取上清液400 μL至塑料进样瓶，用HPLC-MS/MS进行质谱分析。若5倍稀释样品的PQ浓度超过测定的线性范围（0.1 mg/L），则采用乙腈甲酸水溶液10倍、20倍、50倍、100倍或200倍稀释血浆样品后进行分析。
（2）液相色谱条件。色谱柱：XBridge BEH-HILIC（100 mm × 2.1 mm × 2.5 μm），保护柱（5 mm × 2.1 mm × 2.5 μm）；流动相：乙腈∶（100 mmol/L甲酸铵+ 体积分数0.5%甲酸水溶液）= 60∶40，等度洗脱；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL。
（3）质谱条件。离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI +）；质谱扫描方式：多反应监测；碰撞气：12 psi（1 psi = 6 894.757 Pa）；气帘气：35 psi；离子喷雾电压：5 000 V；雾化干燥气温度：650 ℃，雾化气：50 psi，辅助气：55 psi；射入电压：10 V；碰撞室射出电压：13 V。PQ及内标物的多反应监测条件见表 1。
表 1 PQ及内标物的多反应监测条件化合物 母离子m/z 子离子m/z 去簇电压/v 碰撞能量/ eV PQ 171.2 155.2 85 40 77.2 85 52 PQ-d8 179.2 162.2 85 43 82.2 85 52 1.2.4 毒物代谢动力学参数计算
将各时点的PQ血浆浓度录入Data Analysis System 3.0（DAS 3.0）软件，计算房室模型和非房室模型统计矩毒物代谢动力学参数，包括：血药浓度时间曲线下面积（area under curve，AUC）、血药浓度一阶矩时间曲线下面积（first moment area under the curve，AUMC）、平均滞留时间（mean residence time，MRT）、达峰时间（peak time，Tmax）、峰浓度（peak concentration，Cmax）、平均滞留时间方差（variance of mean residence time，VRT）、尾段斜率（elimination rate constant，λz）、尾点血药浓度（last blood concentration，Clast）、半衰期（half life，t1/2）等。
1.2.5 统计学分析
实验数据使用Excel软件进行管理，计量资料结果以均数±标准差（x ± s）的形式描述。应用SPSS 18.0软件对两组动物在观察期间的TK参数进行独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 基本情况
低剂量染毒组的家兔未出现明显中毒症状，高剂量染毒组中2只家兔在染毒后约24 h出现行动缓慢，拒绝饮水和进食，同组其余动物未观察到异常反应。2只出现中毒症状的实验动物分别于染毒后30 h和75 h死亡，后述TK结果均已剔除死亡动物的数据。
2.2 血浆中PQ的检测方法
PQ在10.0 ~ 120.0 μg/L质量浓度范围内线性良好，回归方程：y = 0.053 1 x - 0.020 0；相关系数为0.998 5，PQ在血浆中最低检出限为1.98 μg/L，样品加标回收率在100.2% ~ 106.9%之间，相对标准偏差在2.1% ~ 3.3%之间。
2.3 家兔血浆PQ的浓度-时间曲线
一次性经口染毒后，PQ通过消化道迅速吸收入血，染毒后10 min即可在血浆中检出PQ。低剂量染毒组达峰时间在60 min左右，峰浓度为2.5 mg/L，然后随时间推移迅速降低，在8 h时已降至较低水平，至24 h基本消除。高剂量染毒组的动物血浆PQ浓度在60 ~ 90 min期间达峰，峰浓度为7.3 mg/L，随后逐渐下降，在3 ~ 4 h期间PQ浓度出现持续1 h左右的平台期，随后快速下降，至24 h后达到较低水平，72 h后基本消除。由浓度-时间曲线图可以看出，染毒剂量与血中PQ浓度并非简单线性关系，而是表现为染毒剂量越高，吸收比例越高的趋势。实验期间死亡的2只动物各时点血中PQ浓度均高于同等剂量染毒未死亡的动物。见图 1。
2.4 代谢动力学参数
家兔经口染毒PQ的房室模型呈三室模型分布，房室模型TK参数见表 2，非房室模型统计矩TK参数见表 3。以200 mg/kg的剂量染毒时，相比100 mg/kg PQ染毒，AUC更大、峰浓度更高，差别有统计学意义（P < 0.05）。两组家兔血浆中PQ达峰时间和平均留存时间差异无统计学意义（P > 0.05）。
表 2 PQ的毒物代谢动力学房室模型参数参数 单位 染毒剂量/（mg/kg） t值 P值 100 200 AUC（0 ~ t） mg/（L·h） 19.23 ± 14.21 63.54 ± 42.56 - 2.419 0.036 AUC（0 ~ ∞） mg/（L·h） 19.75 ± 14.23 65.00 ± 42.81 - 2.457 0.034 t1/2α h 1.09 ± 1.86 1 156.13 ± 2 829.33 - 1.000 0.363 t1/2β h 2 424.76 ± 3 500.85 4 631.29 ± 3 563.47 - 1.082 0.305 t1/2γ h 5.50 ± 4.14 -4 168.55 ± 10 222.88 1.000 0.363 V1 L/kg 1 488.04 ± 2 382.90 641.41 ± 1 167.72 0.779 0.454 V2 L/kg （-8.40 ± 20.59）× 108 （-1.09 ± 2.68）×107 - 0.987 0.369 V3 L/kg （8.55 ± 20.95）× 108 （2.05 ± 6.60）×106 0.998 0.364 CL1 L/（h·kg） 2 312.44 ± 3 900.34 1 359.86 ± 2 477.70 0.505 0.625 CL2 L/（h·kg） （-3.46 ± 8.46）× 106 -1 345.81 ± 3 212.53 - 1.000 0.363 CL3 L/（h·kg） （3.45 ± 8.46）×106 301.51 ± 628.66 1.000 0.363 K10 1/h 1.28 ± 0.41 59.81 ± 145.44 - 0.986 0.369 K12 1/h -621.15 ± 1 526.27 -76.03 ± 180.97 - 0.869 0.405 K21 1/h 1.77 ± 2.46 0.07 ± 0.08 1.695 0.151 K31 1/h 0.07 ± 0.09 0.01 ± 0.01 1.865 0.120 K13 1/h 622.96 ± 1 525.13 17.79 ± 35.33 0.972 0.376 Ka 1/h 2.44 ± 2.06 1.72 ± 1.47 0.704 0.498 t1/2ka 1/h 0.90 ± 1.37 0.75 ± 0.70 0.230 0.823 Tmax h 1.96 ± 2.41 1.76 ± 1.10 0.181 0.860 Cmax mg/L 2.37 ± 0.82 7.56 ± 3.14 - 3.918 0.009* 注：AUC：血药浓度-时间曲线下面积；t1/2α：中央室半衰期；t1/2β：第一周边室半衰期；t1/2γ：第二周边室半衰期（消除半衰期）；V1：中央室表观分布容积；V2：第一周边室表观分布容积；V3：第二周边室表观分布容积；CL1：中央室清除率；CL2：第一周边室清除率；CL3：第二周边室清除率；K：速率常数；Ka：吸收速率常数；t1/2ka：吸收半衰期；Cmax：峰浓度；Tmax：达峰时间。 表 3 PQ的毒物代谢动力学非房室模型统计矩参数参数 单位 染毒剂量/（mg/kg） t值 P值 100 200 AUC（0~t） mg/（L·h） 14.06 ± 3.19 72.89 ± 35.15 - 4.083 0.009 AUC（0~∞） mg/（L·h） 14.10 ± 3.21 76.05 ± 34.30 - 4.404 0.007 AUMC（0~t） h2·mg/L 171.50 ± 88.72 993.68 ± 325.32 - 5.972 0.009 AUMC（0~∞） h2·mg/L 175.02 ± 92.99 1356.91 ± 585.59 - 4.883 0.004 MRT（0~t） h 12.09 ± 5.14 14.43 ± 3.17 0.900 0.365 MRT（0~∞） h 12.28 ± 5.23 19.03 ± 8.42 - 1.659 0.128 VRT（0~t） h2 217.79 ± 210.42 340.65 ± 145.82 - 1.175 0.267 VRT（0~∞） h2 230.72 ± 222.02 813.79 ± 771.92 - 1.778 0.127 λz 1/h 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.04 0.717 0.500 t1/2z h 8.41 ± 1.89 15.47 ± 12.11 - 1.140 0.215 Tmax h 1.33 ± 0.41 2.16 ± 1.47 - 1.336 0.232 Vz L/kg 89.88 ± 26.04 67.36 ± 55.40 0.902 0.388 CLz L/（h·kg） 7.49 ± 2.19 2.98 ± 0.99 4.600 0.001 Cmax mg/L 2.53 ± 0.84 9.21 ± 4.43 - 3.629 0.013 Clast mg/L 0.002 ± 0.003 0.07 ± 0.09 - 1.910 0.114 注：AUC：血药浓度-时间曲线下面积；AUMC：血药浓度一阶矩时间曲线下面积；MRT：平均滞留时间；VRT：平均滞留时间方差；λz：尾点斜率；t1/2z：统计矩计算的半衰期；Tmax：达峰时间；Vz：统计矩计算的表观分布容积；CLz：统计矩计算的清除率；Cmax：峰浓度；Clast：尾点血药浓度。 3. 讨论
家兔经口染毒PQ的LD50为50 mg/kg [7]。前期预实验结果显示：对家兔以50 mg/kg或100 mg/kg剂量的PQ灌胃染毒时，家兔无明显中毒反应，200 mg/kg剂量的PQ染毒时家兔可见进食减少但尚未见死亡，400 mg/kg剂量的PQ染毒时家兔全部死亡。GB/T 21750—2008《化学品毒物代谢动力学实验》中要求各剂量组动物不少于4只，为保证在观察期内有足够的存活家兔数，本次实验中分配了8只家兔至高剂量染毒组，6只家兔至低剂量染毒组。
本研究结果显示两组家兔染毒后10 min血浆中即可检测到PQ，表明消化道吸收PQ非常迅速，染毒后1 ~ 2 h左右其血浆PQ浓度可达峰值，随后血浆PQ浓度迅速降低，24 h后血浆中的PQ均已降低到较低的水平。两组家兔血液中的PQ浓度随时间变化的趋势相似。TK参数显示随着染毒剂量由100 mg/kg增大到200 mg/kg，体内毒物的总负荷量增大，但不同染毒剂量下两组达峰时间和平均留存时间差异无统计学意义（P > 0.05）。另外，同组内各实验动物之间同时点血浆中PQ浓度和TK参数差别较大，特别是计算房室模型参数时变异更为明显，反映PQ水剂在家兔消化道的吸收速度和效率有明显的个体差异。
本研究结果显示的家兔血浆PQ变化趋势（浓度-时间曲线）与以往的文献报道基本相同[8-11]。然而，阚歆等[8]报道家兔经口染毒剂量为60 mg/kg时，血浆PQ峰浓度高达14 mg/L，病死率为16%；黄晓亮等[9]报道家兔经口染毒剂量为100 mg/kg时，血浆PQ峰浓度可达7.2 mg/L；陆元兰[10]报道的灌胃染毒剂量为100 mg/kg时，血浆PQ峰浓度为仅为1.7 mg/L，病死率则高达100%。曾薇[11]报道家兔经口染毒剂量为300 mg/kg时，血浆PQ峰浓度虽仅为3.5 mg/L，但病死率高达100%。上述结果与本研究在PQ峰浓度和中毒病死率方面有明显的差异，可能与TK实验采血点的设计、实验观察时间的长短、家兔间个体差异有关，也可能与各实验使用的PQ水剂品牌不同以及样品的前处理与检测PQ的方法不同有关。一般认为口服剂量估测和血药浓度检测在PQ中毒中具有重要作用，PQ中毒程度与摄入的剂量呈正相关，人体PQ摄入量> 40 mg/kg即可引起急性暴发性中毒，摄入量20 ~ 40 mg/kg即可引起中、重度中毒，摄入量 < 20 mg/kg表现为轻度中毒[12]，但本研究结果提示单纯以口服剂量和血浆中PQ浓度预测预后仍具有一定的局限性。
传统TK动物实验多以大小鼠等啮齿类动物为实验动物，非啮齿类动物多选择比格犬等大动物进行。大小鼠体型较小，耐受采血量也较少，不适合毒性高、血药浓度低、检测采血量要求大的毒物TK实验。比格犬价格较贵，饲养条件较为苛刻，也限制了使用范围。以家兔为实验动物的TK实验发现，家兔体型较大，性情温顺，便于灌胃操作，耳中央动脉可以耐受多次较大量的采血，适用于毒性高、血药浓度低的毒物TK实验，也较易开展消化道毒物清除、血液净化实验等后续实验操作[13]。但是同时也观察到家兔个体遗传背景差异较明显，经口染毒时毒物吸收、代谢、排泄变异较大，影响测定TK参数的准确性和稳定性。
综上，本研究获得了不同染毒剂量下PQ在家兔体内的浓度-时间曲线和毒物代谢动力学参数，构建的TK模型与暴露后的TK参数相拟合，能较好地描述血浆中PQ浓度随时间的变化规律，研究结果为后续研究提供了基础性数据。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 尘肺病合并肺结核情况
病种 尘肺病总数 合并肺结核 合并率/% 合并病例年龄/岁 合并病例工龄/年 煤工尘肺 4 761 107 2.25 60.21 ± 8.33 21.49 ± 10.27 矽肺 2 898 77 2.66 55.99 ± 9.73 13.94 ± 9.58 混合尘肺 76 3 3.94 50.33 ± 8.96 22.60 ± 4.16 水泥尘肺 19 2 10.53 58.00 ± 0.01 14.50 ± 0.71 合计 7 785 189 2.43 58.31 ± 9.08 18.35 ± 10.53 
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表 2 尘肺病合并肺结核病例分期情况
病种 尘肺病壹期 尘肺病贰期 尘肺病叁期 合计 煤工尘肺 10 19 78 107 矽肺 12 16 49 77 混合尘肺 0 0 3 3 水泥尘肺 1 0 1 2 合计 23 35 130 189 合并率/% 1.00 1.89 3.56 2.42
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