Protective effect of glycyrrhizic acid monosaccharide on acute lung injury caused by single-walled carbon nanotubes in mice
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+ English摘要:目的 评估甘草酸单糖(glycyrrhizic acid monoglucuronide，GAMG)对单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNT)诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用。方法 取7 ~ 8周龄雌性C57/BL小鼠30只，随机分为3组，每组10只，分别为阴性对照组(生理盐水40 μg/只，气管滴注)、SWCNT模型组(SWCNT 40 μg/只，气管滴注)、GAMG治疗组(SWCNT 40 μg/只，气管滴注+ GAMG 200 mg/kg)，GAMG治疗组每天给予1次GAMG腹腔注射，连续3 d，其他组同时给予空白溶剂，在第3天对小鼠进行取材。观察各组小鼠肺组织HE染色病理改变和气管肺泡灌洗液中细胞因子白介素-6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的变化，采用免疫组化法检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的蛋白表达水平，免疫荧光法检测NF-κB和HSP47的含量。结果 GAMG治疗组小鼠肺损伤程度明显减轻。与SWCNT组相比，GAMG治疗组BALF中MCP-1和IL-6水平降低(P < 0.01)；TLR4和MyD88的表达减少，肺组织NF-κB p65和HSP47蛋白表达减少(P < 0.01)。结论 GAMG可显著改善SWCNT诱导的急性肺损伤，并抑制肺内TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。
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碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)是由单层或多层石墨烯片碳原子卷成的中空、无缝的管状物质，根据结构可分为单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNT)和多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNT)，纳米材料具有优异的机械强度、导热性和光学性能，广泛应用于工商业，包括电子产业、能源产业、建筑材料和医疗保健器材等行业[1]。由于CNTs的纳米级别、纤维样形状等理化特征，它们在生产环境中易经呼吸道吸入，从而成为一种新型的职业病危害因素[2]。有研究发现小鼠肺部CNTs暴露会导致炎症反应，包括白细胞浸润、促炎细胞因子及趋化因子的释放，进而导致弥漫性肺损伤和肺纤维化[3]。在病理水平上，CNTs诱导的肺纤维化与尘肺病高度相似[4]。因此，CNTs材料的职业暴露引发广泛关注。
甘草酸单糖(glycyrrhizic acid monoglucuronide，GAMG)是甘草酸去除侧葡萄糖醛酸的活性代谢产物[5]，甘草酸是中药甘草中主要的生物活性成分，具有良好的抗炎活性，能够改善肺纤维化的炎症反应、氧化应激、上皮间充质转变等[6]。GAMG作为甘草酸的活性中间体，药理活性增强，具有更好的抗肿瘤、抗炎、抗过敏和抗病毒活性[6-7]。前期研究表明GAMG能缓解SWCNT诱导的肺部炎症，但抗急性肺损伤的作用机制尚不完全清楚[8-9]。本研究拟通过观察GAMG对SWCNT诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用，探讨GAMG缓解小鼠急性肺损伤的分子机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
GAMG为安徽医科大学药学院合成，通过高效液相色谱(型号：Agilent 1200，色谱柱：Elite，RP-C18，5 μm × 4.6 mm × 150 mm)测定GAMG的纯度(质量分数)为96.0%。SWCNT(XFS05)来自南京XFNANO材料技术有限公司。SWCNT的长度为1 ~ 3 μm，纯度(质量分数)为90%。SWCNT混悬液配制：将SWCNT溶解在磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，配制浓度为200 μg/mL，用超声细胞粉碎仪超声1 h进行混匀备用，使用时再根据浓度进行配比稀释。GAMG溶液配制：将50 mg GAMG粉末先溶解在0.5 mL的二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，放在4 ℃冰箱进行储存，使用时根据浓度用PBS进行配比稀释。
实验动物为雌性C57BL/6小鼠，7 ~ 8周龄，体质量19 ~ 23 g，30只，购自安徽医科大学实验动物中心。所有动物实验方案均经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
30只小鼠随机分为3组，每组10只，分为阴性对照组、SWCNT模型组和GAMG治疗组。SWCNT模型组一次性给予每只小鼠50 μL含40 μg的SWCNT混悬液(按体质量计算约1.86 mg/kg)进行气管滴注，进行急性肺损伤造模。阴性对照组给予PBS进行气管空白滴注。GAMG治疗组在SWCNT模型组的基础上给予GAMG 200 mg/kg，腹腔注射，每天给药1次，连续3 d；为避免小鼠的过度损伤，第1次在造模前1 h给药。阴性对照组以及SWCNT模型组同时腹腔注射空白溶剂。在第3天给药2 h后对小鼠进行小鼠肺组织和小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的取材。模型制备及GAMG治疗剂量参考课题组前期实验结果[7, 9]，SWCNT在40 μg/只时小鼠肺部可产生明显的病理变化。此外，这个剂量与人类工作场所的暴露剂量类似[8]。
1.2.2 肺泡灌洗液中炎性细胞因子的检测
每组选取6只小鼠，收集肺泡灌洗液，低温超速离心机(美国Beckman Coulter公司)13 000 r/min(离心半径15 cm)离心3 min后，用ELISA试剂盒(Novus公司)测定炎性细胞因子白介素-6(IL-6)以及人巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量。
1.2.3 组织学评价
对每组剩余4只小鼠处死取肺组织，所取得肺组织用体积分数4%的多聚甲醛保存，放置2 d，使肺组织充分在多聚甲醛溶液中固定，之后再进行脱水，包蜡和切片(5 μm)。用苏木精和伊红(HE)染色观察病理组织，免疫组化观察信号通路TLR4/MyD88/NF-κB的相关蛋白表达水平，免疫荧光染色观察NF-κB以及热休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)的表达量，从每个样本中提取代表性图像(放大倍数× 200)，分别用炎症分级指标进行评判，以及Image J软件进行分析。
1.2.4 统计学分析
所有数据均以(x ± s)描述，用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布且总体方差相同的数据，采用单因素方差分析，并进行Dunnett多重比较。不符合正态分布的数据采用Kruskal-Wallis检验进行分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 GAMG对急性肺损伤小鼠肺组织的保护作用
HE染色显示，阴性对照组小鼠肺组织肺泡结构完整，炎症细胞浸润极少(图 1A)；SWCNT模型组小鼠肺组织中肺泡结构损伤明显，肺组织的完整性破坏较明显，可以明显观察到炎症细胞浸润(图 1B)；而GAMG治疗组小鼠肺组织病理改变较SWCNT模型组减轻(图 1C)。
2.2 GAMG对急性肺损伤小鼠BALF中炎性细胞因子的影响
SWCNT暴露3 d后各组小鼠IL-6和MCP-1水平比较，差异具有统计学意义(P < 0.01)；进一步两两比较，SWCNT模型组小鼠肺组织IL-6和MCP-1含量较阴性对照组提高，差异具有统计学意义(P < 0.01)。GAMG治疗组小鼠肺组织IL-6和MCP-1含量较SWCNT模型组均出现不同程度的降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)，见表 1。
表 1 各组小鼠肺组织的IL-6和MCP-1含量比较(n = 6，pg/mL) 组别 IL-6 MCP-1 阴性对照组 56.84 ± 6.34 72.67 ± 2.52 SWCNT模型组 159.25 ± 9.03① 190.00 ± 10.00① GAMG治疗组 95.31 ± 4.88② 125.00 ± 5.00② F值 165.435 236.816 P值 < 0.001 < 0.001 注：①与阴性对照组相比，P < 0.01；②与SWCNT模型组相比较，P < 0.01。 2.3 GAMG对急性肺损伤小鼠TLR4、MyD88、NF-κB通路的影响
p65蛋白的核易位通常被认为是NF-κB激活的一个标志，因此测量p65蛋白的含量可显示NF-κB的水平。各组小鼠TLR4、MyD88、NF-κB含量差异有统计学意义(P < 0.01)。免疫组化染色显示，阴性对照组小鼠肺组织TLR4、MyD88和NF-κB p65含量极少(图 2的A、D、G)。与阴性对照组相比，SWCNT模型组肺组织中TLR4和MyD88的表达增加，NF-κB通路激活p65蛋白水平升高(图 2的B、E、H)(P < 0.01)(见表 2)。而在GAMG治疗组中，TLR4和MyD88的表达量相比于SWCNT模型组减少(P < 0.01)(见表 2)，肺损伤肺组织中NF-κB通路被抑制，p65蛋白表达被有效阻断(图 2的C、F、I)。因此，甘草酸单糖降低了SWCNT诱导的急性肺损伤中的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。
表 2 各组小鼠肺组织的TLR4、MyD88、NF-κB含量比较(n = 3) 组别 TLR4 MyD88 p65 阴性对照组 5.32 ± 1.04 9.25 ± 1.18 5.23 ± 0.61 SWCNT模型组 43.26 ± 2.49① 88.68 ± 7.49① 68.56 ± 7.51① GAMG治疗组 18.15 ± 2.50② 18.36 ± 2.86② 27.52 ± 2.11② F值 247.186 258.833 151.526 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：①与阴性对照组相比，P < 0.01；②与SWCNT模型组相比，P < 0.01。 2.4 GAMG对急性肺损伤小鼠肺组织中NF-κB和HSP47的影响
我们借助测量p65蛋白的含量显示NF-κB的水平。阴性对照组、SWCNT模型组、GAMG治疗组的HSP47和p65含量分别为5.19 ± 1.06、32.97 ± 2.83、15.98 ± 1.91，差异有统计学意义(F =138.132，P < 0.01)，具体表现为阴性对照组 < GAMG治疗组 < SWCNT模型组(P < 0.01)。免疫荧光结果显示，阴性对照组小鼠NF-κB p65和HSP47的含量极少(图 3的A ~ D)；SWCNT模型组明显诱导小鼠肺组织中p65和HSP47的表达升高，三色重叠偏白色(图 3的E ~ H)，SWCNT模型组肺组织中HSP47和p65表达增加；而GAMG治疗组有效抑制了p65和HSP47的产生(图 3的I ~ L)，HSP47和p65的表达相比于SWCNT模型组减少。
3. 讨论
SWCNT细颗粒可通过呼吸道吸入沉积在肺部。SWCNT的气管灌注方法简单、可重复性好，是目前应用最广泛、最经典的暴露方法[10]。SWCNT暴露后的主要病理变化是引起肺泡屏障损伤、肺泡水肿和炎症细胞浸润[11]。而肺巨噬细胞的过度募集和免疫反应可导致炎症细胞因子释放，增加血管通透性，最终引起肺水肿。因此，通过减轻炎症细胞因子的级联反应有助于减轻模型组的急性肺损伤症状[12]。
甘草酸在脂多糖诱导的肺损伤中表现出抗炎作用，其抗炎机制与抑制氧化应激、降低NF-κB表达以及减少炎症细胞浸润有关[13]。GAMG作为甘草酸的活性中间体，药理活性增强，具有更好的抗炎和抗氧化等多种生物活性作用，具有很高的生物安全性[14]。在本研究中，GAMG可减轻SWCNT诱导的小鼠肺组织病理改变，减少肺部炎症细胞浸润，抑制炎症细胞因子IL-6和MCP-1的释放。
在本研究中，初步发现甘草酸单糖的抗炎作用机制可能与抑制TLR4和NF-κB蛋白表达有关。Toll样受体TLR4激活，在病原体识别、免疫激活和炎症反应过程中发挥关键作用[15]。TLR4信号通路通过MyD88激活NF-κB，最终导致炎症相关因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的表达增加，加重组织的损伤[16]。因此，抑制TLR4的激活有助于减少炎症因子释放，减轻氧化应激反应和肺组织损伤[17]。本研究中GAMG抑制了TLR4和MyD88，以及NF-κB的信号通路的蛋白表达量，缓解了SWCNT诱导的小鼠急性肺损伤。
碳纳米管诱导的急性肺损伤会进一步导致肺纤维化，其特征是细胞外基质的过度沉积，特别是胶原蛋白，是肺纤维化的一个重要原因。热休克蛋白47(HSP47)被用作成纤维细胞的标志物，是一种胶原蛋白的结合蛋白，在细胞内对前胶原蛋白的激活过程中发挥重要作用，在肺纤维化胶原的合成中具有必不可少的作用[18]。免疫荧光表明GAMG能够抑制小鼠肺组织的NF-κB p65和HSP47的蛋白激活，减轻炎症因子释放，进一步缓解肺部损伤。
综上所述，甘草酸单糖通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，缓解了SWCNT诱导的小鼠急性肺损伤。本研究为今后将甘草酸单糖可能应用于急性肺损伤的治疗方面提供了实验依据。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 各组小鼠肺组织的IL-6和MCP-1含量比较
(n = 6，pg/mL) 组别 IL-6 MCP-1 阴性对照组 56.84 ± 6.34 72.67 ± 2.52 SWCNT模型组 159.25 ± 9.03① 190.00 ± 10.00① GAMG治疗组 95.31 ± 4.88② 125.00 ± 5.00② F值 165.435 236.816 P值 < 0.001 < 0.001 注：①与阴性对照组相比，P < 0.01；②与SWCNT模型组相比较，P < 0.01。 
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表 2 各组小鼠肺组织的TLR4、MyD88、NF-κB含量比较
(n = 3) 组别 TLR4 MyD88 p65 阴性对照组 5.32 ± 1.04 9.25 ± 1.18 5.23 ± 0.61 SWCNT模型组 43.26 ± 2.49① 88.68 ± 7.49① 68.56 ± 7.51① GAMG治疗组 18.15 ± 2.50② 18.36 ± 2.86② 27.52 ± 2.11② F值 247.186 258.833 151.526 P值 < 0.001 < 0.001 < 0.001 注：①与阴性对照组相比，P < 0.01；②与SWCNT模型组相比，P < 0.01。
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