Determination of urinary trichloroacetic acid by headspace gas chromatography mass spectrometry after controlling chloroform interference
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+ English摘要:目的 建立能解决三氯甲烷干扰的尿中三氯乙酸顶空-气质联用测定方法。方法 利用三氯乙酸水浴加热脱羧后形成三氯甲烷的原理，使用顶空-气质联用法分别检测样品水浴前、水浴后的三氯甲烷峰面积，依据峰面积差值对应的浓度计算三氯乙酸浓度。结果 采用该方法测定尿中三氯乙酸，在0.01 ~ 50 mg/L范围内线性良好，相关系数为0.999 9，方法检出限0.2 μg/L，回收率为96.8% ~ 100.4%，相对标准偏差为1.5% ~ 2.3%。样品在室温、4 ℃和-25 ℃中可保存14 d。三氯甲烷低于10 mg/L时对测定无干扰。结论 该方法简便、快捷、准确，适用于职业人群和中毒患者尿中三氯乙酸的测定。
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三氯乙烯是一种常用的有机溶剂，广泛应用在五金、化工、电子等行业。三氯乙烯具有致癌性，职业性三氯乙烯药疹样皮炎因其高致死率以及严重的皮肤和肝功能损害，是我国危重职业病之一，近年来有多例职业接触三氯乙烯引起的中毒甚至中毒死亡的报道[1-4]。三氯乙烯主要的代谢产物是三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），我国以尿中TCA质量浓度50 mg/L作为三氯乙烯职业接触的生物限值[5]。
目前国内测定尿中TCA的方法主要有顶空-气相色谱法或气质联用法[6-11]、衍生化-液液萃取-气相色谱法[12-14]、顶空固相微萃取-气质联用法[15]、离子色谱法[16]、液相色谱法[17-18]，衍生萃取法、离子色谱法和液相色谱法的前处理过程繁琐，需要消耗大量试剂。现行行业标准及报道比较多的方法是顶空法，简便快捷。顶空法测定是先将TCA水浴加热脱羧成三氯甲烷，然后通过顶空进样，检测三氯甲烷来测定TCA。但是，未见有报道说明样品测定的三氯甲烷是尿中既有的，还是由TCA加热脱羧生成的，即无法排除既有三氯甲烷的干扰。
本研究拟通过顶空-气质联用法分别检测样品加热前、加热后的三氯甲烷峰面积，峰面积差值对应浓度即为准确的尿中三氯乙酸浓度，建立能抗三氯甲烷干扰的尿中三氯乙酸顶空-气质联用测定方法，准确测定职业人群和中毒患者尿中三氯乙酸含量。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
7694E-7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent科技公司）；AE-200电子天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒公司）；HH-4恒温水浴锅（常州国华电器公司）；20 mL顶空钳口玻璃瓶；纯水机（美国密理博公司）。
1.1.2 试剂
三氯甲烷（色谱纯，天津市津科精细化工研究所）；三氯乙酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。实验所用纯水：纯水煮沸，冷却至室温。空白混合尿液：取多名健康志愿者尿液混合，经测定尿中TCA质量浓度小于检出限。
1.2 仪器条件
1.2.1 顶空条件
顶空瓶温度：55 ℃；定量圈温度：70 ℃；传送带温度：90 ℃。加热平衡时间：10 min；加压时间：0.2 min；定量圈充满时间：0.2 min；定量圈平衡时间：0.05 min。进样体积：1 mL。
1.2.2 气相色谱条件
色谱柱DB-5MS 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；柱温：45 ℃保持2 min，以20 ℃/min程序升温升至145 ℃，保持1 min；进样口温度230 ℃；柱流速1 mL/min；进样方式：分流进样，分流比10∶1。
1.2.3 质谱条件
电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度：230 ℃；接口温度250 ℃；扫描方式：全扫描模式；扫描范围：质荷比（m/z）45 ~ 300。采用保留时间和特征离子碎片（m/z为83、85、47）进行定性，采用定量离子（m/z为83）峰面积进行定量。
1.3 标准曲线
1.3.1 标准溶液配制
分析天平准确称量TCA纯品，使用纯水溶解并定容至100 mL，配制成约10 g/L的TCA贮备液，将此贮备液置于4 ℃冰箱保存。临用前用纯水稀释成100 mg/L的标准应用液。
1.3.2 标准曲线绘制
取8个顶空瓶，分别加入一定量的TCA标准应用液，加纯水至5 mL，配成浓度为0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、50.00 mg/L的标准溶液，钳紧顶空瓶盖，放入90 ℃水浴锅中保持90 min，取出放至室温后，放入顶空进样器中，按步骤1.2仪器条件测定。以TCA浓度为横坐标，以各标准溶液点测得的定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.4 样品测定
分别取尿液样品5.0 mL于两个顶空瓶中，立即钳紧瓶盖，其中一个顶空瓶放入顶空进样器，按步骤1.2仪器条件测定得到定量离子峰面积A1；另一个顶空瓶放入90 ℃水浴锅中保持90 min，取出放至室温后，放入顶空进样器中，按步骤1.2仪器条件测定得到定量离子峰面积A2。根据标准曲线，峰面积的差值（A2 - A1）对应的TCA质量浓度即为准确尿液中TCA的质量浓度（mg/L）。
2. 结果与讨论
2.1 水浴温度和时间的选择
根据TCA的行业标准检测方法及相关报道，脱羧温度均选择90 ℃ [6-11]。因此本研究选择水浴温度为90 ℃进行脱羧反应。在其他条件相同的情况下，本研究选择了水浴脱羧时间分别0、30、60、90、120、150、180 min进行试验。结果显示，随着时间增加，测定峰面积逐渐增大，当水浴时间超过90 min时，峰面积变化不大。因此本文选择水浴脱羧时间为90 min。见图 1。
2.2 顶空时间的选择
将浓度50 mg/L的TCA标准溶液经过90 ℃水浴90 min，取出放至室温后，放入顶空进样器中，顶空温度为55 ℃，分别选择顶空时间为5、10、20、30 min进行试验。结果显示，顶空时间10 min时，峰面积最大，因此本文选择顶空时间为10 min。见图 2。
2.3 顶空温度的选择
本研究考察了TCA样品、三氯甲烷样品在有、无水浴的情况下，不同顶空温度对测定结果的影响。
2.3.1 顶空温度对TCA样品峰面积的影响
将浓度50 mg/L的TCA标准溶液分为两组：1组不水浴、1组水浴，然后分别于顶空温度45、55、65、75 ℃下平衡10 min后测定。结果显示，随着顶空温度升高，不水浴样品的峰面积逐渐增大；水浴样品的峰面积逐渐增大，温度超过65℃后，峰面积减小。见表 1。
表 1 顶空温度对TCA样品峰面积的影响顶空温度/℃ 峰面积 不水浴 水浴 45 1 441 2 515 709 55 2 000 2 553 632 65 3 928 3 632 643 75 14 616 2 525 061 2.3.2 顶空温度对三氯甲烷样品峰面积的影响
将浓度10 mg/L的三氯甲烷标准溶液分为两组：1组不水浴、1组水浴，然后分别于顶空温度45、55、65、75 ℃下平衡10 min后测定。结果显示，随着顶空温度升高，不水浴样品的峰面积逐渐增大；水浴样品峰面积逐渐减小，在55 ℃时三氯甲烷样品在水浴和无水浴的测定结果相对相差小于1%。见表 2。
表 2 顶空温度对三氯甲烷样品峰面积的影响顶空温度/℃ 峰面积 不水浴 水浴 45 931 240 1 046 236 55 988 588 980 304 65 1 133 337 788 413 75 1 146 732 732 044 2.3.3 水浴对TCA样品峰面积的影响
将浓度为5、10、50、100、150 mg/L的TCA标准溶液分为两组：1组不水浴、1组水浴，然后于顶空温度55 ℃下平衡10 min后测定。结果显示，顶空温度为55 ℃时，不同浓度的TCA在不水浴时测定结果与水浴时测定结果的比值均小于0.2%。见表 3。
表 3 不同浓度TCA样品水浴、不水浴的测定结果TCA质量浓度/（mg/L） 不水浴样品峰面积 水浴样品峰面积 峰面积比值/% 5 0 261 280 0 10 309 512 465 0.06 50 1 138 2 424 122 0.05 100 4 363 4 142 133 0.11 150 5 715 5 622 238 0.10 注：峰面积比值指不水浴样品峰面积与水浴样品峰面积的比值。 根据以上实验结果，本研究选择顶空温度为55 ℃，在水浴后测定能保持较高的峰面积，满足样品中TCA在不水浴时测定结果（c1）不影响水浴后测定的结果（c2），同时样品中的三氯甲烷在不水浴、水浴的情况下测定结果相对相差小于1%。
2.4 标准曲线和检出限
按照优化后的条件，将TCA质量浓度为0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、50.00 mg/L的标准溶液，按上述步骤1.3.2进行测定，绘制线性方程。TCA质量浓度在0.01 ~ 50.00 mg/L的范围内线性良好、相关系数（r）为0.999 9。以质量浓度为0.01 mg/L TCA溶液中定量离子响应的3倍信噪比（S/N）对应的样品浓度作为检出限，以10倍信噪比对应的样品浓度作为定量限，结果本方法检出限为0.2 μg/L，定量限为0.5 μg/L。
2.5 方法加标回收率和精密度
取混合尿样分为5组，每组6个样品，1组为空白，其余4组分别加入TCA的质量浓度为1、10、25、50 mg/L，按步骤1.4进行测定。测定结果减去空白结果后，计算加标回收率和相对标准偏差。加标回收率在96.8% ~ 100.4%之间，相对标准偏差在1.5% ~ 2.3%之间。见表 4。
表 4 方法加标回收率和精密度（n = 6）加标质量浓度/（mg/L） 加标回收率/% 平均回收率/% RSD/% 1 2 3 4 5 6 1 101.0 102.5 101.2 102.2 99.2 96.5 100.4 2.3 10 101.3 97.3 96.7 97.4 98.2 96.8 98.0 1.7 25 99.8 97.5 97.7 95.8 96.4 96.0 97.2 1.5 50 96.0 100.2 95.6 97.9 95.7 95.4 96.8 2.0 2.6 稳定性试验
将TCA质量浓度为50 mg/L的尿液样品分成3组，分别置于室温（25 ~ 30 ℃）、4 ℃、-25 ℃中保存，分别在第1、3、7、14天各测定1组样品，计算下降率。结果显示，在室温、4 ℃和-25 ℃保存3、7、14 d时，TCA下降率均小于10%。说明样品可在室温、4 ℃和-25 ℃保存14 d。
2.7 干扰试验
顶空法测定尿中TCA的干扰物主要是三氯甲烷，即无法分辨测定的三氯甲烷是尿中既有的，还是由TCA脱羧生成的。试验：分别将TCA质量浓度为0、10 mg/L的尿液样品分成4组，1组不加干扰物，其余3组分别加入1、10、50 mg/L的三氯甲烷，按步骤1.4进行测定。结果显示，空白尿液中随着三氯甲烷浓度增大，导致空白尿液中TCA测定结果从无到有、逐渐增大。在10 mg/L TCA尿液样品中，随着三氯甲烷的浓度增大，TCA测定结果逐渐减小，即测定结果受到三氯甲烷水浴前、水浴后峰面积变化的影响，同时三氯甲烷的存在会抑制三氯乙酸的脱羧反应，从而导致测定结果偏低。与不加干扰物样品测得结果比较，当三氯甲烷浓度低于10 mg/L时，对本研究测定结果造成的相对偏差小于± 10%，表示无干扰。见表 5。
表 5 干扰试验TCA加标浓度/（mg/L） 三氯甲烷浓度/（mg/L） 测定结果/（mg/L） 偏差（mg/L） 0 0 0 0 1 0 0 10 0.3 0.3 50 4.0 4.0 10 0 9.7 0 1 9.5 - 0.2 10 8.8 - 0.9 50 6.3 - 3.4 3. 结论
本方法采用顶空-气质联用法测定尿中TCA，从干扰试验、水浴时间、顶空平衡温度、顶空平衡时间等方面优化实验条件，建立了能抗三氯甲烷干扰的尿中三氯乙酸顶空-气质联用测定方法。实验期间，本研究将标准曲线做到100、150 mg/L，但响应值不符合线性拟合，符合二次方程拟合。样品直接取样、密封、水浴、上机测定，样品前处理操作简便。水浴脱羧90 min，顶空平衡和气质联用分析10 min，可同时处理多个样品。本方法简便、快捷、准确，适用于职业人群和中毒患者尿中三氯乙酸的测定。
作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突 -
表 1 顶空温度对TCA样品峰面积的影响
顶空温度/℃ 峰面积 不水浴 水浴 45 1 441 2 515 709 55 2 000 2 553 632 65 3 928 3 632 643 75 14 616 2 525 061 
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表 2 顶空温度对三氯甲烷样品峰面积的影响
顶空温度/℃ 峰面积 不水浴 水浴 45 931 240 1 046 236 55 988 588 980 304 65 1 133 337 788 413 75 1 146 732 732 044
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表 3 不同浓度TCA样品水浴、不水浴的测定结果
TCA质量浓度/（mg/L） 不水浴样品峰面积 水浴样品峰面积 峰面积比值/% 5 0 261 280 0 10 309 512 465 0.06 50 1 138 2 424 122 0.05 100 4 363 4 142 133 0.11 150 5 715 5 622 238 0.10 注：峰面积比值指不水浴样品峰面积与水浴样品峰面积的比值。
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表 4 方法加标回收率和精密度（n = 6）
加标质量浓度/（mg/L） 加标回收率/% 平均回收率/% RSD/% 1 2 3 4 5 6 1 101.0 102.5 101.2 102.2 99.2 96.5 100.4 2.3 10 101.3 97.3 96.7 97.4 98.2 96.8 98.0 1.7 25 99.8 97.5 97.7 95.8 96.4 96.0 97.2 1.5 50 96.0 100.2 95.6 97.9 95.7 95.4 96.8 2.0
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表 5 干扰试验
TCA加标浓度/（mg/L） 三氯甲烷浓度/（mg/L） 测定结果/（mg/L） 偏差（mg/L） 0 0 0 0 1 0 0 10 0.3 0.3 50 4.0 4.0 10 0 9.7 0 1 9.5 - 0.2 10 8.8 - 0.9 50 6.3 - 3.4
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